Заключение

    Лечение дегенеративных заболеваний сетчатки – это сложная задача на стыке фундаментальных медико-биологических наук и клинической офтальмологии. Одним из наиболее перспективных и патогенетически ориентированных направлений в этой области является трансплантация клеток РПЭ. Можно выделить основные вопросы, которые возникают у исследователей всего мира при подготовке РПЭ к трансплантации [240, 27]:

    1. Какому источнику клеточного материала следует отдавать предпочтение с учетом действующего законодательства?

    2. Как сохранить вмешательство микроинвазивным?

    3. Как избежать осложнений, связанных со спонтанной диссеминацией и миграцией клеток РПЭ?

    4. Как сохранить эпителиальный фенотип клеток РПЭ, которые стремятся к эпителиально-мезенхимальной трансформации?

    При анализе доступной литературы была выдвинута обоснованная гипотеза о том, что перечисленные требования могут быть удовлетворены при использовании для трансплантации в субретинальное пространство аллогенного ретинального пигментного эпителия в форме многоклеточных сфероидных микроагрегатов. Была сформулирована цель исследования -разработать технологию предоперационной подготовки аллогенного ретинального пигментного эпителия методом трехмерного клеточного культивирования для трансплантации.

    Для решения поставленной цели были поставлены задачи:

    1. Разработать технику микрохирургического выделения клеток ретинального пигментного эпителия из трупных донорских глаз человека для трансплантации.

    2. Разработать технологию подготовки ретинального пигментного эпителия к трансплантации методом трехмерного клеточного культивирования.

    3. Изучить в эксперименте морфологические критерии трансплантабельности 3D клеточных сфероидов ретинального пигментного эпителия, подготовленных по предложенной технологии.

    4. Изучить в эксперименте процесс реконструкции фрагмента слоя ретинального пигментного эпителия при помощи сфероидов в условиях in vitro.

    5. Изучить в эксперименте адгезивные свойства клеточных сфероидов ретинального пигментного эпителия в условиях органной культуры хороидально-пигментного комплекса

    Исследование было проведено в пять этапов, соответственно пославленным задачам

    На первом этапе мы разрабатывали методику выделения клеток РПЭ для трансплантации из ГЯДТ.

    Для выделения РПЭ в опытной группе было использовано 11 ГЯДТ от 11 доноров, разделенных на две группы по показателям адреналиновой пробы С.А. Борзенка – Проба А (6 глаз) и Проба В (5 глаз). Среднее время от момента энуклеации составило 6,2±1,4 и 8,0±2,7 часов, соответственно; средний возраст донора - 34,5±10,5 и 39,4±4,5 лет, соответственно. В контрольной группе было использовано 11 парных глаз от тех же 11 доноров, что и в опытной. Для препарирования использовали стандартный офтальмохирургический инструментарий и стандартные методы оперативной хирургии.

    Суть известной методики заключается в том, что после удаления корнео-склерального диска из донорского глазного яблока удаляют иридо-хрусталиковую диафрагму, стекловидное тело, отслаивают и иссекают сетчатую оболочку при сохранении целостнсти склерального бокала; к склеральной оболочке изнутри прилежит сосудистая оболочка вместе со слоем РПЭ; далее из получившегося бокала извлекают клетки РПЭ ферментативной и механической дезагрегацией [1].

    Разработанная в настоящей работе методика отличается тем, что из ГЯДТ последовательно удаляют склеральную и сосудистую оболочку с прилежащим к последней слоем РПЭ (ХПК); после чего с внутренней поверхности ХПК ферментативно и механически извлекают клетки РПЭ. Методика не имеет аналогов и защищена патентом РФ. Было показано, что при должном уровне мануальной техники представляется возможным извлекать клетки РПЭ из донорского глаза при сохранении целостности витреальной полости и сетчатки и соответствии уровня жизнеспособности выделяемых клеток таковому при использовании известной методики препарирования.

    На втором этапе работы разрабатывали методику подготовки РПЭ взрослого донора-трупа к трансплантации методом 3D клеточного культивирования. Была использована методика культивирования суспензии клеток РПЭ в виде висячих капель в различных режимах – исследовалась динамика формирования сфероидов при различных посевных количествах клеток на висячую каплю и при различных сроках 3D культивирования.

    Было выявлено, что формирование сфероидов РПЭ в пространстве висячих капель происходит в течение первой недели со статистически незначимым уменьшением их размеров в последующие недели. Сфероиды, образующиеся в процессе 3D культивирования, различались по характеру поверхности: одни – были «гладкими», другие – были покрыты «бахромой» клеточного дебриса. Первые обладали способностью уменьшаться в размерах, сливаться друг с другом, а также могли покрываться «бахромой». В то же время «бахромчатые» сфероиды не меняли своего размера, не сливались друг с другом и не изменяли характера поверхности. Sato R. et al. упоминают, что им удалось зарегистрировать на поверхности сфероидов РПЭ от взрослого донора образование тонкой соединительнотканной оболочки (мембраны Бруха, по Sato R et al.) [235]. Однако, текстовое и фотографическое описание оболочки сфероидов в упомянутой статье отличается от описания в настоящей работе, а такие противопоставленные характеристики поверхности сфероидов, как гладкость или наличие окружающей оболочки из клеточного материала, даны не были. Поэтому в настоящей работе впервые использованы оригинальные термины, характеризующие морфологию сфероидов РПЭ – «гладкий» и «бахромчатый».

    При иммуногистохимическом исследовании 2D культур РПЭ и полученных из них сфероидов различной морфологии и различных сроков культивирования выявлены изменения экспрессии иммуногистохимических маркеров – снижение RPE65 и E-кадгерина и повышение виментина при продолжительном 2D культивировании, а также обратные явления при переводе клеток РПЭ из 2D культур в 3D – нарастание экспрессии RPE65 и Е-кадгерина со снижением экспрессии виментина. Это позволяет подтвердить ранее полученные данные о том, что процесс эпителиально-мезенхимальной трансформации клеток, запущенный двухмерным культивированием, может быть обращен при их трехмерном культивировании [96, 150].

    Анализ диаметра сфероидов позволяет оценить возможность их имплантации в субретинальное пространство при помощи современных витреоретинальных технологий. Так, при сравнении диаметра «гладких» сфероидов на 7 сутки 3D культивирования с внутренним диаметром витреоретинальных игл оказалось, что наиболее подходящими для имплантации с помощью технологий 25-27 Gauge могут являться сфероиды, сформированные в висячих каплях с посевными концентрациями менее 5000 клеток на висячую каплю. В доступных литературных источниках данных о подготовке РПЭ в форме сфероидов для субретинальной трансплантации хирургическими инструментами определенного калибра обнаружено не было.

    На третьем этапе работы исследовали показатели трансплантабельности сфероидов РПЭ, получаемых по технологии, разработанной на втором этапе исследования. Использовали два критерия трансплантабельности сфероидов – жизнеспособность составляющих сфероид клеток и адгезивные свойства сфероидов по отношению к стандартному субстрату. Исследовали трансплантабельность сфероидов различной морфологии (гладкие и бахромчатые) и различных посевных количеств клеток.

    Была выявлена зависимость трансплантабельности сфероидов РПЭ от трех параметров предтрансплантационного 3D культивирования. Сроки 3D культивирования более 14 дней негативно сказывались на жизнеспособности и адгезивных свойствах сфероидов – более выражено в сфероидах с большими количествами клеток, менее выражено в сфероидах с меньшими количествами. Вкупе с фактом, что сфероиды РПЭ не имеют тенденции к увеличению в размерах при 3D культивировании это может быть объяснено тем, что клетки РПЭ внутри сфероида не имеют тенденции к делению, а общая жизнеспособность сфероида снижается необратимо, что косвенно указывает на их онкологическую безопасность. По данным работы Sato R с соавт. [235] жизнеспособность клеток в составе сфероидов резко падала в течение первой недели до 30%, после чего снижалась умеренно. По данным настоящей работы жизнеспособность клеток «гладких» сфероидов с меньшими исходными посевными количествами падала до 90-75% в первую неделю, а в сфероидах с посевными количествами свыше 5000 клеток на висячую каплю – до 40-35%, что было сравнимо с данными Sato R и соавт. [235], если учесть, что посевные количества клеток в одном сфероиде в указанной работе составляли от 2 до 7 тыс. клеток. Спустя 7 суток культивирования жизнеспособность сфероидов изменяется незначительно.

    Количество клеток, составляющих сфероид РПЭ влияет на его трансплантабельность. В работе было показано, что жизнеспособность клеток в составе сфероида падает пропорционально изначальным посевным количествам клеток в одной висячей капле. Спустя 7 суток 3D культивирования жизнеспособность клеток в составе «гладких» сфероидов снижалась на 91, 89, 76, 40 и 34 % при исходных посевных количествах 500, 1000, 5000, 25000, 125000 клеток, соответственно. Полученные нами данные согласуются с представлением о некротической гибели клеток в ядре разрастающихся сфероидов опухолевых клеток и могут быть объяснены тем, что, поскольку сфероид является бессосудистой структурой, то его максимальный стабильный размер должен ограничиваться диффузией питательных веществ [88].

    Морфология сфероида косвенно указывает на их трансплантабельность. Поскольку выделение такой классификационной категории как характер поверхности сфероида РПЭ («гладкий» или «бахромчатый» сфероид) произведено впервые в рамках настоящей работы, то и информация о трансплантабельности сфероидов, различных по характеру поверхности, является оригинальной и в опубликованной ранее научной литературе аналогов не имеет. При прогнозировании приживления сфероида «гладкая» поверхность - есть признак однозначно более благоприятный, такие сфероиды обладают высшими значениями жизнеспособности составляющих их клеток и могут адгезировать к поверхности субстрата. «Бахромчатые» сфероиды последней особенности лишены. Целью дальнейших исследований может явиться выяснение вопроса о природе «бахромы», появляющейся при снижении жизнеспособности клеток на поверхности сфероида (состоит ли она лишь из нежизнеспособных клеток или включает компоненты межклеточного матрикса), а также вопроса о возможности адгезии «бахромчатого» сфероида при изменении условий трансплантации (например, при его механической аппланации, очистки от «бахромы»), учитывая остаточную жизнеспособность клеток в сфероидах с «бахромой».

    Четвертый изученный фактор – показатель адреналиновой пробы донорских глаз, явившихся первичным источником донорского материала, статистически значимого влияния на свойства сфероидов не оказал. Вероятнее всего, это можно объяснить тем, что первичное культивирование и первые 2D пассажи сами по себе являются естественным тестом на жизнеспособность, определяющим перспективы дальнейшего 3D культивирования. Очевидно, что если количество жизнеспособных клеток в исходном материале недостаточно, то культура не достигает конфлюэнтности при последовательных пересевах и деградирует уже на 1-2 пассаже, поэтому в данной работе естественным образом отбирались стабильные конфлюэнтные культуры 5-6 пассажа. Подобных исследований в отношении взаимосвязи результатов адреналиновой пробы донорского глаза – источника культуры РПЭ и их жизнеспособности ранее не проводилось.

    На четвертом этапе работы исследовали способность сфероидов РПЭ, подготовленных по разработанной технологии, к реконструкции слоя РПЭ в эксперименте in vitro, на поверхности стандартной культуральной посуды. Известно, что из всех испробованных на сегодня форм трансплантатов донорского РПЭ наилучшими результатами обладали трансплантаты лоскутов фетального РПЭ - фетальная ткань проявила способность к распространению вокруг себя слоя клеток, к «наползанию» на соседние области, что позволяет меньше травмировать зону интереса, приживляя трансплантат рядом [29, 220, 240]. Однако в силу этических запретов использование данного источника материала остается затруднительным. Зрелая соматическая ткань РПЭ таким свойством не обладает. Однако, известен феномен распространения клеточных слоев по поверхности субстрата при пересадке многоклеточных сфероидов различного клеточного состава, в том числе и зрелых соматических. В рамках данной работы предположена возможность использования данного феномена при имплантации сфероидов РПЭ в субретинальное пространство.

    Сконструированные по разработанной технологии сфероиды РПЭ, сформированные при посевном количестве 1000 клеток на висячую каплю, обладающие «гладкой» морфологией и культивированные в 3D условиях в течение 7 дней, переносили из висячих капель на дно лунок культуральных планшетов и наблюдали за реконструкцией клеточного слоя в течение 28 дней.

    По данным настоящего исследования, сфероиды РПЭ с указанными параметрами способны реконструировать вокруг себя слой клеток РПЭ на ограниченном протяжении. Образуемый слой клеток является неоднородным с различимыми зонами «ядра» клеточного слоя, пояса многоклеточного эпителия и периферической зоны клеточного монослоя. Клеточный слой на периферии, несмотря на пониженное содержание пигмента в цитоплазме, обладает признаками нативного РПЭ – клетки имеют форму, близкую к гексагональной. Напротив, клетки в контроле, образовав монослой из клеточной суспензии, имеют отростчатую и вытянутую форму.

    Традиционно при трансплантации РПЭ в форме клеточной суспензии её вводят непосредственно над зоной fovea [54, 84]. Подтвержденный в данной работе факт спрединга клеточного слоя вокруг сфероидов РПЭ позволяет дать рекомендации по возможному использованию сфероидов РПЭ для реконструкции слоя клеток РПЭ в субретинальном пространстве. Представляется вероятным располагать сфероиды вокруг зоны интереса (например, зоны fovea) на некотором расстоянии от нее (200 -300 мкм), а не непосредственно на ней, как это происходит.

    Клеточный слой распространяется вокруг сфероида ограниченно, что указало на отсутствие выраженного пролиферативного процесса в образуемом слое клеток и позволило вкупе с другими результатами настоящей работы предварительно считать имплантацию сфероидов РПЭ в субретинальное пространство процессом безопасным с точки зрения онкологической трансформации.

    Имплантация суспензии клеток РПЭ сопровождается риском обратного рефлюкса клеток в витреальную полость, неконтролируемой диссеминации в субретинальном пространстве как живых клеток, так и нежизнеспособного клеточного и внеклеточного материала [192, 84, 72].

    В то же время, по данным настоящего исследования, слой клеток, образующийся вокруг сфероидов, являлся единым, не распадался на отдельные клетки ни на одном из изученных этапов – ни при имплантации, ни во время приживления, ни при его деградации, что должно снизить риск неконтролируемой диссеминации клеток РПЭ и клеточного дебриса в полостях глаза.

    На пятом этапе работы исследовали адгезивные свойства сфероидов донорского РПЭ, подготовленных по разработанной технологии и отобранных по критериям трансплантабельности, в условиях органной культуры аллогенного хороидально-пигментного комплекса (ХПК). В качестве модели реципиента использовали фрагменты ХПК, механически зафиксированные в разработанной держалке на основе крышки-замка от полипропиленовой пробирки «Эппендорф» объемом 1,5 мл. Фиксированный фрагмент ХПК обрабатывали ферментативной смесью и механически зачищали слой РПЭ на ограниченной области. В зачищенную зону переносили сфероиды РПЭ, подготовленные на основе тех же клеточных культур, использованных на предыдущих этапах работы. Поскольку и донорская, и реципиентная ткани принадлежали разным донорам, моделируемая трансплантация носила аллогенный характер.

    Большая часть трансплантированных сфероидов РПЭ (72%) прикрепилась в первые сутки, а на третьи сутки вокруг области прикрепления начал распространяться слой клеток РПЭ, сопоставимых по размеру и форме с клетками нативного РПЭ, однако отличающимися от последних пониженным содержанием пигмента.

    Пигментация клеток ретинального пигментного эпителия определяется содержанием в них пигмента меланина, синтез которого в норме прекращается на 3-4 недели внутриутробного развития, после чего наблюдают его перераспределение в созревающих меланиновых гранулах в постнатальном периоде и постепенное объединение с липофусцином во взрослом состоянии [46, 233]. В клеточных культурах РПЭ взрослого человека наблюдается постепенное обесцвечивание клеток, связанное с постепенным распределением пигмента материнской клетки между двумя дочерними при делении первой [87, 45]. Поэтому депигментация клеток РПЭ взрослого донора в культуре не вызывает удивления.

    Нативная форма клеток РПЭ взрослого донора в стандартной плоскостной культуре при стандартных методах культивирования с каждым пассажем становится все менее и менее гональной и все более отростачтой [168], что и наблюдалось при 2D культивировании суспензии клеток РПЭ. Однако при культивировании РПЭ в форме сфероидов на плоскости in vitro (разд. 3.4) и в органной культуре ХПК на поверхности деэпителизированной мембраны Бруха (разд. 3.5) был обнаружен феномен восстановления полярности клеток на периферии образуемого вокруг сфероидов клеточного слоя, что подтверждает теорию о существовании обратимой эпителиально-мезенхимальной трансформации в многоклеточных сфероидах [17] и дает основание для дальнейших исследований в области использования сфероидов РПЭ при регенерации клеточного слоя РПЭ в субретинальном пространстве.