Заключение

    Аденовирусные заболевания принято делить на аденовирусный конъюнктивит (АВК), который может быть вызван серотипами аденовируса 3, 4, 6, 7а, реже – 1, 5, 10, 16; и эпидемический кератоконъюнктивит (ЭКК), причиной которого наиболее часто являются серотипы 8, 11, 19, 29, 37, 54 [2, 12, 28, 82]. Известно, что конъюнктивит с точечными эпителиальными и субэпителиальными инфильтратами роговицы, наблюдаемый при вспышках или спорадических случаях аденовирусных заболеваний, может быть вызван не только указанными выше серотипами, но и 1, 2, 3, 7, 9, 16, 21 и др. серотипами аденовируса [12, 28]. В связи с этим в ряде работ встречается обобщающее понятие аденовирусного кератоконъюнктивита (АВКК) [81, 82, 94, 116, 120].

    В течение АВКК ранее было выделено 4 стадии: 1 – острые конъюнктивальные проявления, 2 – поражение роговицы, 3 – выздоровление, 4 - стадия формирования вторичного синдрома «сухого глаза» [1, 9, 10, 12, 94]. Однако, при анализе современного течения аденовирусного процесса Майчук Д.Ю. с соавт. (2011) выделяют самостоятельную 5-ю стадию, которая характеризуется повторным появлением роговичных инфильтратов в период 2,5 – 3 месяца от начала заболевания [11].

    В связи с разнообразием существующих данных о клинических особенностях аденовирусных заболеваний глаз, учитывая большое количество известных серотипов аденовируса и описанную зависимость клинического течения от типа вируса, а также появление все новых серотипов в процессе изучения заболевания, первой задачей данного исследования стало – систематизировать клинический опыт диагностики и терапии АВКК. В результате проведенной ретроспективной статистической обработки амбулаторных карт пациентов с аденовирусным поражением глаз за период с 2008 г. по 2012 г., а также по результатам наблюдения за пациентами с острым и подострым течением АВК и АВКК в период с 2012 г. по 2014 г. были получены данные, которые подтверждают ранее известное деление клинического течения острого АВКК на 4 стадии [12, 94], а также существование этапа повторного развития постАВ поражения роговицы в виде субэпителиальных помутнений.

    Кроме того, в ходе исследования были определены следующие особенности эпидемиологии и клинического течения аденовирусного процесса глаз в современной локальной популяции:

    • постепенное увеличение длительности течения основных четырех стадий аденовирусного процесса глаз на 16,67 % по сравнению с сезоном 2008-2010 г.г.;

    • расширение стадий процесса по времени в среднем на 2-3 дня;

    • увеличение общего числа пациентов с аденовирусной патологией глаз на 3,7 % по сравнению с сезоном 2008-2010 г.г. и на 15,46 % по сравнению с сезоном 2010-2012 г.г.;

    • прогрессирующее увеличение количества пациентов с инфильтративным поражением роговицы от 28,7 % в сезон 2008-2010 г.г. до 59,82 % в сезон 2012-2014 г.г.;

    • появление пациентов (14,43%) с формированием рецидивирующего инфильтративного поражения роговицы в сезон 2010-2012 г.г. и увеличение их количества до 59,82 % в сезон 2012-2014 г.г.

    Появление стадии повторного развития постАВ помутнений роговицы так же может служить доказательством теории хронизации АВКК.

    Часть ученых склоняется к существованию только острого аденовирусного процесса [2, 12], но на сегодняшний день преобладает мнение о наличии хронического течения аденовирусных заболеваний глаз. Данную теорию подтверждает тот факт, что наряду с острыми формами АВКК стали встречаться осложненные, затяжные, рецидивирующие и хронические формы [1, 6, 19]. Такие изменения в течении АВКК можно связать с особенностями возбудителя, со снижением общего иммунного фона населения, а так же с нерационально подобранным лечением.

    При описании клинической картины постАВ поражения роговицы в данной работе было показано, что при повторном развитии субэпителиальных помутнений в 70% случаев не отмечено реакции со стороны конъюнктивы. Поэтому для оценки эпидемиологической и патогенетической заинтересованности латентного вирусного инфицирования в развитии рецидивирующей формы АВКК нами была проведена ПЦР-диагностика аденовируса в мазках с конъюнктивы. У пациентов с пленчатой формой АВКК наблюдалось постепенное уменьшение количества положительных результатов теста в сроки от первого дня заболевания до трех месяцев от начала патологического процесса. На сроке 3 месяца от начала АВКК отрицательные результаты были получены в 100 % случаев. Кроме того, аденовирус не был обнаружен у всех пациентов с повторным развитием роговичных помутнений в отдаленные сроки после острого периода АВКК.

    Учитывая отрицательные результаты ПЦР-диагностики аденовируса в конъюнктивальных мазках, а так же наличие клинически спокойной конъюнктивы, интерес представило более детальное изучение микроскопической структуры роговичных постАВ помутнений. В данной работе была поставлена задача – определить in-vivo патоморфологическую картину постАВ поражения роговицы на этапе повторного появления постАВ помутнений (3 и более месяцев после острого процесса). По данным литературы при изучении структуры АВ инфильтратов с помощью конфокальной микроскопии в подострую стадию ЭКК были обнаружены кластеры гиперрефлективных клеток в слое базального эпителия, смешанные с округлыми клетками (лейкоцитами). На стадии резорбции роговичных инфильтратов плотность и размер кластеров дендритных клеток уменьшились, но была выявлена гиперрефлективность стромы. Таким образом, что при ЭКК происходит ранняя активация иммунной системы (дендритных клеток), а воспаление выражается значительно и затрагивает глубокие слои роговицы [39]. То есть, уже в острую фазу заболевания в роговице отмечается асептическое иммунное воспаление.

    При исследовании методом конфокальной микроскопии в данной работе отдельное роговичное помутнение определялось как округлый участок фибропластической реакции в поверхностных слоях стромы, распространяющийся на глубину до 40-65 мкм. В этой зоне были выявлены гипоцеллюлярность и снижение прозрачности экстрацеллюлярного матрикса, а так же признаки активации кератоцитов в парацентральных частях помутнения. Кроме того, в периферических зонах помутнения были обнаружены скопления клеток Лангерганса, которые участвуют в распознании антигенов, синтезе лимфокинов и простагландинов и в стимуля-ции Т-лимфоцитов, при этом не участвуют в фагоцитарных реакциях. Кроме того, клетки Лангерганса способны длительно удерживать на своей поверхности антигены, являясь тем самым участниками феномена иммунологической памяти [7, 68]. Соответственно, данные клетки свидетельствуют об усиленной аутоиммунной активности в зоне границы помутнения и здоровой ткани роговицы, что доказывает наличие асептической иммунной реакции у пациентов с постАВ помутнениями, даже в отдаленные после острого периода сроки наблюдения. При этом состояние слоев стромы рядом с зоной локализации помутнения и эндотелия оставалось неизмененным. Состояние эпителия роговицы как в зоне над помутнением, так и в других отделах роговицы оценивалось как псевдокератинизация эпителиоцитов, что является оправданным, учитывая наличие вторичного синдрома «сухого глаза» у данных пациентов.

    С целью оценки системного иммунного ответа у пациентов с инфильтративным поражением роговицы после перенесенного АВКК было проведено исследование состояния клеточного ответа к антигенам роговицы с помощью РТМЛ в венозной крови пациентов. У всех рассматриваемых пациентов (10 человек) по результатам исследования крови был получен отрицательный результат, то есть индекс миграции находился в пределах от 0,80 до 1,20. Получение отрицательных результатов у данной группы пациентов обусловило ограниченный набор и отсутствие необходимости увеличения количества пациентов для исследования. Результаты свидетельствуют об отсутствии системной аутосенсибилизации пациентов к антигенам роговицы, несмотря на наличие выраженного постаденовирусного поражения, а в отсутствии признаков наличия аденовируса в структурах передней поверхности глаза можно говорить о наличии лишь локальной иммунной воспалительной реакции. Информации об изучении системного иммунного ответа у пациентов с постАВ поражением роговицы в литературе обнаружено не было.

    Выделяют 3 основных направления в лечении и профилактике вирусных заболеваний:

    – химиотерапия;

    – специфическая иммунотерапия (вакцины, иммуноглобулины), но для лечения аденовирусных заболеваний глаз специфическая вакцинация не может быть использована из-за онкогенных свойств вакцины;

    – неспецифическая иммунотерапия (интерферон и его индукторы – иммуностимуляторы, интерфероногены) [5].

    На завершающем этапе развития аденовирусного поражения глаз, в том числе и при повторном развитии роговичных субэпителиальных инфильтратов, наиболее эффективным методом терапии, признано применение местных кортикостероидов [12, 81]. Однако, терапия с помощью препаратов, содержащих стероиды, имеет и свои побочные действия, такие как повышение внутриглазного давления, развитие катаракты и глаукомы [3]. В связи с этим актуальной проблемой является поиск эффективной терапии постаденовирусных субэпителиальных инфильтратов роговицы без побочных эффектов кортикостероидов.

    Для решения указанной проблемы, а также с целью клинической оценки схем возможной лекарственной терапии рецидивирующей инфильтративной формы АВКК все пациенты с постаденовирусным поражением роговицы в виде субэпителиальных точечных помутнений (127 человек – 203 глаза) были разделены на 4 статистически равнозначные группы в зависимости от назначенного лечения:

    Группа I – инстилляции глазных капель Дексаметазон 0,1% (начиная с 4-х раз в день, с последующим снижением кратности инстилляций) в течение 12 недель (32 человека – 52 глаза).

    Группа II – глазной гель Ганцикловир 0,15% (Зирган®, Santen (Финляндия)) по схеме (5 раз в день в течение 14 дней, зате м 3 раза в день в течение 7 дней, в соответствии с инструкцией производителя) + дексаметазон 0,1% по убывающей схеме в течение 12 недель (30 человек – 49 глаз).

    Группа III – Циклоспорин А 0,05% (Рестасис®, Allergan (США)) 2 раза в день в течение 6 месяцев, в соответствии с инструкцией фирмы-производителя + дексаметазон 0,1% по убывающей схеме в течение 12 недель (33 человека – 51 глаз).

    Группа IV – Офтальмоферон (Фирн-М, Россия) 6 раз в день в течение 10 дней + дексаметазон 0,1% по убывающей схеме в течение 12 недель (32 человека – 51 глаз).

    Токсическо-аллергических реакций на компоненты применяемых лекарственных средств не было отмечено ни одной из групп пациентов на протяжении всего периода терапии.

    На разных этапах наблюдения во всех группах были определены закономерности в состоянии пациентов. Так, на сроках 1 и 3 месяца от начала лечения статистически достоверной разницы между показателями всех групп замечено не было, что мы связываем с наличием в терапии основного действующего вещества – дексаметазона – в одинаковых дозировках. При этом отмена кортикостероидов приводила к развитию симптоматики и клинической картины, сходной с таковой до начала терапии, в группах I, II и IV . У пациентов в группе III мы наблюдали стабилизацию клинического состояния в отдаленные сроки наблюдения, что мы связываем с пролонгированным применением препарата с противовоспалительными свойствами (0,05 % ЦсА), который является одним из перспективных противовоспалительных препаратов в современной офтальмологии.

    Основной клеткой-мишенью для данного препарата являются Т-хелперы. При этом ЦсА блокирует выработку интерлейкинов-2, -3, -4 и γ-интерферона Т-клетками. Подавляя Т-хелперами продукцию интерлейкина-2, циклоспорин тем самым ингибирует пролиферацию и образование Т-киллеров в начальных фазах их развития. При этом он не воздействует на субпопуляции Т-супрессоров. Также циклоспорин подавляет дегрануляцию тучных клеток и базофильных гранулоцитов, одновременно угнетая продукцию интерлейкинов-3 и -4 этими клетками. В низких концентрациях при местном применении препарат оказывает противовоспалительное и иммуномодулирующее действие [63, 64, 105].

    Учитывая особенности иммунологического действия применяемых лекарственных веществ, в группах с наиболее значимыми результатами терапии постаденовирусного поражения роговицы для оценки терапии было произведено изучение локального иммунологического статуса путем исследования экспрессии генов цитокинов в культуре клеток конъюнктивального соскоба и определения содержания самих цитокинов в надосадочной жидкости. В офтальмологии основным методом изучения локального цитокинового статуса является иммуноферментный анализ (ИФА), а объектом для изучения концентрации свободных цитокинов является слезная жидкость [21, 45]. Но при описании клинических особенностей было показано, что у пациентов с поражением роговицы после перенесенного АВКК уже отсутствуют клинические признаки активной воспалительной реакции (конъюнктива спокойна), поэтому изучение самих медиаторов иммунного ответа в слезе могло дать недостаточные или неполные данные о состоянии локального цитокинового статуса у данных пациентов. Поэтому было принято решение провести оценку локальных уровней продукции цитокинов в культуре клеток конъюнктивального соскоба методом ИФА с параллельной качественной оценкой процесса тканевой экспрессии генов цитокинов методом ОТ-ПЦР. По литературным данным такое сочетание позволяет более полно оценить состояние исследуемой группы цитокинов у обследуемых пациентов [6].

    При оценке иммунологического статуса у пациентов с постАВ поражением роговицы в сроки 3 и более месяцев после перенесенной острой стадии заболевания была отмечена статистически достоверно более высокая (в 2,1 раза), чем у здоровых лиц, продукция ИФН-α, что может свидетельствовать о том, что, несмотря на отсутствие клинических проявлений воспалительного процесса со стороны конъюнктивы, у пациентов, перенесших острый аденовирусный процесс 3 и более месяцев назад, сохраняется противовирусный иммунитет. Кроме того, продукция ИЛ-8, одного из острофазовых цитокинов, у пациентов до лечения была достоверно выше (в 2,8 раза), чем у здоровых лиц. У пациентов до лечения также была отмечена активация гуморального иммунитета, что проявилось в достоверном увеличении содержания цитокина ИЛ-4 (в 1,65 раза) в надосадочной жидкости конъюнктивальных соскобов до лечения.

    Изучение цитокинового статуса при различных заболеваниях является одним из ведущих направлений. В офтальмологии так же этот вопрос находится на пике изучения, но в случае инфекционных заболеваний глаз, причиной которым послужил аденовирус, этот вопрос освещен лишь в нескольких источниках, большинство из которых касаются острой фазы заболевания. Лишь в единственном отечественном источнике авторы Кочергин С.А., Чернакова Г.М., Клещева Е. А. и др. [8] изучали динамику интенсивности местной воспалительной реакции и синтеза цитокинов у пациентов, как в острой фазе аденовирусного процесса, так и в условиях его хронизации. Авторы так же показали, что клетки конъюнктивы в норме способны экспрессировать гены цитокинов (ИФН-α, ИФН-γ, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-18, ФНО-α) и вырабатывать цитокины (ИФН-γ, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-13, ФНО-α, ГМ-КСФ) в широком диапазоне значений [6, 8]. Необходимо отметить, что в вышеуказанной работе изучение проводилось у пациентов на фоне хронизации воспалительного процесса после перенесенного ранее АВК.

    Информации по изучению локального цитокинового статуса у пациентов с инфильтративной рецидивирующей формой АВКК в отдаленном периоде после перенесенного острого процесса в литературе обнаружено не было. Поэтому интерес представляло не только понять местный цитокиновый статус у данной группы пациентов, но и изучить его особенности на фоне применяемого лечения.

    В результате изучения локального цитокинового статуса как в группах здоровых людей и пациентов до начала терапии, так и в группах I и III на фоне противовоспалительной терапии определяемые значения количества цитокинов в пробах варьировали в широких пределах.

    В группах I и III на фоне 1 месяца лечения с применением основного действующего вещества – дексаметазона – наблюдалось снижение уровня синтеза противовирусного ИФН-α (в 1,4 и 1,54 раза соответственно) до значений, достоверно не отличающихся у здоровых лиц (р < 0,05). В группе III у пациентов на фоне длительного применения комбинированной противовоспалительной терапии в течение 4-х месяцев отмечается полное подавление продукции ИФН-α. При этом в обеих группах на фоне лечения отмечалось угнетение синтеза ИФН-α уже на посттранскрипционном уровне, а уровень транскрипции этого цитокина оставался более высоким, чем у здоровых лиц.

    Достоверно увеличенное до лечения количество цитокина ИЛ-4 продолжало постепенно расти на фоне противовоспалительной терапии в обеих группах, что может косвенно свидетельствовать об активации гуморального иммунитета. Максимальное значение ИЛ-4 отмечено на сроке 4 месяца от начала терапии в группе III (комбинированное лечение). У всех пациентов в обеих группах наблюдалось угнетение продукции провоспалительного ИЛ-2 на фоне лечения, хотя уровень транскрипции этого цитокина соответствовал здоровым лицам. Так как ИЛ-2 является активатором Th-1–типа иммунного ответа, можно косвенно судить об угнетении клеточного звена иммунитета.

    Как уже было отмечено, у пациентов до лечения продукция одного из основных провоспалительных цитокинов ИЛ-8 была достоверно выше (в 2,8 раза), чем у здоровых лиц. Причем, терапия дексаметазоном (Группа I) способствовала активации синтеза ИЛ-8, что проявилось уже на уровне транскрипции. При этом экспрессия генов и содержание ИЛ-8 оставались высоким даже после отмены лечения (контроль на сроке 4 месяца терапии).

    В группе III, где исследование проводилось на фоне комбинированной терапии, уровень транскрипции ИЛ-8 на сроке 4 месяца от начала терапии достоверно не отличался от показателя здоровых лиц. Показатели количественной оценки ИЛ-8 в данной группе так же подвергались постепенному снижению. Учитывая высокую провоспалительную активность ИЛ-8, полученные результаты могут свидетельствовать о преобладании воспалительной реакции у пациентов до начала лечения, которая оставалась на высоком уровне и на фоне монотерапии дексаметазоном. Соответственно, лечение в группе I не привело к стабилизации процесса, в отличие от пациентов группы III, получавших более длительное противовоспалительное лечение с включением препарата 0,05% ЦсА, которое позволило добиться стабилизации воспалительной реакции, как на клиническом, так и на иммунологическом уровне.

    В результате исследования наилучшие клинико-функциональные результаты в группе III (схема терапии с применением официнального препарата 0,05 % ЦсА) были подтверждены иммунологическими параметрами, а именно, на фоне лечения произошло полное подавление продукции ИФН-α; усиление активности регулятора гуморального иммунитета (плавное увеличение количества ИЛ-4); снижение концентрации провоспалительного ИЛ-2, активатора клеточного звена иммунитета, вплоть до полного его подавления; отмечалось восстановление уровня транскрипции провоспалительного цитокина ИЛ-8 до значений, достоверно не отличающихся от таковых у здоровых лиц, и постепенное снижение количественного содержания цитокина.