Заключение

    Эксимерлазерная коррекция аметропий является самым эффективным, безопасным и высокотехнологичным способом в современной кераторефракционной хирургии. В настоящее время методом выбора при эксимерлазерных вмешательствах является операция LASIK (лазерный in situ кератомилез), что обуславливается быстрым восстановлением зрительных функций и безболезненным периодом реабилитации за максимально короткие сроки в послеоперационном периоде. В современной рефракционной эксимерлазерной хирургии риск интраоперационных осложнений, благодаря новым совершенным моделям микрокератомов, сведен к минимуму. А современные высокоточные эксимерлазерные системы позволяют получить желаемый запланированный рефракционный эффект.

    Однако очевидно, что формирование роговичного лоскута не только приводит к нарушению анатомической целостности роговицы и ее иннервации, но и индуцирует комплекс изменений, влияющих на ее биомеханические свойства [97, 133, 138, 154, 163].

    Метод ФРК в настоящее время пользуется меньшей популярностью среди рефракционных хирургов и пациентов, из-за более длительного и болезненного послеоперационного периода, хотя является альтернативным при определенных анатомических особенностях роговицы [33, 46, 48, 95]. На сегодняшний день многие офтальмохирурги по всему миру пересмотрели свое отношение к этому методу кератофрефракционной хирургии и считают «безножевую» технику ФРК более щадящей, по сравнению с методом LASIK, в плане сохранения биомеханических функций и восстановления структурных изменений роговицы [155, 203].

    Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод о том, что большинство фоторефракционных операций на роговице сопровождаются ослаблением ее биомеханический свойств, что в ряде случаев может привести к возникновению индуцированной ятрогенной кератэктазии. До недавнего времени исследования в этом направлении практически не освещались в мировой литературе, однако на сегодняшний день известна проблема возникновения такого осложнения у пациентов после проведения фоторефракционных операций. С таким осложнением в первую очередь столкнулись рефракционные хирурги при выполнении операции LASIK. При данном типе операции еще на стадии формирования роговичного лоскута возникает ослабление прочностных характеристик роговицы на 20-30%, и это ослабление только усиливается с увеличением объема абляции [122, 203, 202, 208].

    Наиболее оптимальным способом лечения и предупреждения подобных осложнений до сих пор являлся кросслинкинг роговичного коллагена и различные методы его комбинирования с фоторефракционными операциями [105, 133, 154, 163, 211].

    Несмотря на прогресс в данном направлении, комбинирование кросслинкига роговицы с фоторефракционными операциями на ней д о настоящего времени не получило широкого распространения в клинической практике. Это связано с целым рядом нежелательных побочных эффектов, обусловленных ультрафиолетовым облучением роговицы при кросслинкинге, описанными ранее [15, 59, 167, 169, 193, 204].

    Также стоит отметить, что процедура кросслинкинга коллагена роговицы по стандартному протоколу противопоказана к применению при значениях показателей кератопахиметрии менее 400 мкм. А, поскольку, истончение центральных отделов роговицы является ключевым признаком у пациентов после фоторефракционных операций, а также патогенетическим фактором механизма возникновения кератэктазий, роговицы с толщиной менее 400 мкм – далеко не редкость. Таким образом, данный критерий заметно сужает круг пациентов, которые могли б ы быть пролечены с применением стандартного протокола (и его вариациями) кросслинкинга, а также его комбинациями с фоторефракционной абляцией [7, 11, 14, 75, 76, 87].

    Основой данного исследования явилось предложение использовать вторичное УФ-излучение, возникающее в результате рассеивания монохроматического 193 нм лазерного излучения в глубжележащих слоях стромы роговицы в ходе фоторефракционной абляции, для разработки методики лазериндуцированного кросслинкинга, с последующей оценкой его эффективности, выявлению фотопротекторного эффекта и комплексным морфофункциональным исследованием посредством световой и трансмиссионой электронной микроскопии. Имеющиеся работы по изучению особенностей спектральной абсорбции рибофлавина, трансформированию 193 нм излучения эксимерного лазера при абляции роговицы и механизму кросслинкинга роговичного коллагена не снижают актуальности настоящего исследования [174, 178, 180, 224].

    Цель исследования – разработать и дать экспериментальное обоснование технологии фоторефракционной кератоабляции с фотопротекцией и эффектом кросслинкинга.

    Для достижения поставленной цели решались следующие задачи исследования:

    1) разработать в экспериментах ex vivo и in vivo методику фоторефракционной кератэктомии с фотопротекцией и эффектом кросслинкинга;

    2) дать клиническую оценку состоянию роговицы и определить наличие фотопротекторного эффекта при фотоабляции с рибофлавином в экспериментах in vivo;

    3) в экспериментах ex vivo и in vivo провести тензиометрическую оценку упруго-прочностных свойств роговицы, а также оценить влияние фотосенсибилизатора на скорость и глубину абляции после кератэктомии с предварительным насыщением стромы изото ническим раствором рибофлавина;

    4) по данным световой микроскопии проанализировать морфологические изменения после лазериндуцированного кросслинкинга при эксимерлазерной абляции роговицы без и с рибофлавином в экспериментах in vivo;

    5) доказать наличие эффекта лазериндуцированного кросслинкинга при фоторефракционной абляции с рибофлавином посредством трансмиссионной электронной микроскопии.

    Предложенная методика фоторефракционной кератоабляции с фотопротекцией и эффектом кросслинкинга была разработана и смоделирована в экспериментах ex vivo и in vivo. В качестве материала экспериментальных исследований было использовано 90 глазах 90 кроликов породы Шиншилла массой от 2,5 до 3,5 кг.

    Фоторефракционная абляция роговиц в экспериментах выполнялась на эксимерлазерной установке Wavelight-Allegretto 200 (США) в условиях отделения лазерной микрохирургии глаза ЦКДК «НМХЦ им. Н.И. Пирогова». Дозированная абляция стромы роговицы проводилась без и с предварительным 3-минутным аэрозольным насыщением 0,25% изотоническим раствором рибофлавина. Данный тип насыщения стромы роговицы фотосенсибилизатором включает в себя ряд преимуществ перед обычным капельным способом, который применяется в современной технологии классического и ускоренного кросслинкинга. Анализ кривых капельного насыщения роговицы показал, что уже через 3-5 минут рибофлавин накапливается в достаточной концентрации на глубине 200 -300 мкм [144, 175, 182, 205]. А поскольку временной интервал абляции, как правило, не превышает 1 минуты, то нет необходимости в применении декстрана для поддержания концентрации на необходимом уровне. Аэрозольное орошение 0,25% изотоническим раствором рибофлавина с помощью ультразвукового небулайзера позволило интенсифицировать насыщение стромы, что связано с высокой дисперсностью аэрозольных частиц и способствует их более быстрому и глубокому проникновению в строму роговицы. Кроме того, при такой технологии исключалось образование неравномерного слоя раствора рибофлавина на поверхности стромы перед проведением её фоторефракционной абляции, что могло стать причиной остаточной аметропии с эффектами гипер- или гипокоррекции. Оценка разницы клинического течения производилась в эксперименте in vivo на 32 глазах 32 кроликов. Животные были разделены на две группы: группа 1.1 – 16 глаз 16 животных, на которых была выполнена трансэпителиальная ФРК без и с предварительным насыщением стромы роговицы изотоническим 0,25% раствором рибофлавина на глубину 100 мкм; группа 1.2 – 16 глаза 16 животных, которым была выполнена трансэпителиальная ФРК без (подгруппа 1.1А, 8 глаз) и с предварительным насыщением (подгруппа 1.1.Б, 8 глаз) стромы роговицы изотоническим 0,25% раствором рибофлавина на глубину 50 мкм. Контрольные осмотры осуществлялись на 1-е, 3-и, 7-е, 14-е и 21-е сутки после эксперимента и осуществлялись посредством прямой офтальмоскопии с помощью ручного офтальмоскопа. Динамика эпителизации, а также состояние эпителия оценивались с применением синего фильтра и раствора флюоресцеина.

    Клиническая оценка офтальмологического статуса животных проводилась по балльной системе. Максимально возможный балл оценки составлял 27 баллов, минимально возможный – 0 баллов. Оценивались следующие критерии: слезотечение, светобоязнь, эпителизация, состояние эпителия и отечность стромы.

    На протяжении всего периода наблюдений, в обеих группах выявлена клиническая разница в выраженности воспалительных и регенераторных процессов. Так, на глазах после абляции с рибофлавином все вышеперечисленные негативные реакции проходили заметно менее выраженно, о чем свидетельствуют среднебалльные оценки экспериментальных животных из обеих групп. У животных группы 1.2 в случае абляции с рибофлавином полная эпителизация наступала раньше (чаще к 3-м суткам, против 7-х суток, в случае абляции без предварителльного насыщения рибофлавином), слезотечение и светобоязнь практически полностью исчезали к концу 3-х суток.

    Стоит отметить, что в группе 1.1 на всех этапах контрольных осмотров клинический статус животных не был удовлетворительным. Уже на ранних сроках послеоперационного периода полученные клинические данные позволили судить о проведённом избыточном объеме абляции (для данного вида животных), что привело к возникновению ответной асептической воспалительно-регенераторной реакции, выраженной в появлении множественных «хейзов», неполной эпителизации, устойчивом помутнении стромы роговицы, а также сохранявшегося дефекта эпителия в центральной оптической зоне роговицы. Однако именно в этой экспериментальной группе разница между глазами, аблированными без и с предварительным насыщением рибофлавином, была наиболее выраженной. Достоверная разница среднебалльных значений определялась уже с 3-х суток и сохранялась до конца периода наблюдений. Так, к 3-м суткам средний балл клинического состояния у животных после трансФРК с рибофлавином составлял 6,7±1,4, тогда как у животных после абляции без рибофлавина он был равен 9,8±4,6 (p< 0,05). К концу 7-х суток средний балл составлял 4,3±3,9 и 7,5±2,6 соответственно. На 14-е сутки средний балл у животных после фотоабляции с рибофлавином был равен 3,2±1,9, в то время как у животных после трансФРК без рибофлавина – 6,3±2,6. К концу периода наблюдений (21-е сутки) средний балл у животных после трансФРК с рибофлавином составлял 3,8±1,0, против 6,3±3,0 у животных после абляции без рибофлавина.

    Таким образом, на протяжении всего периода наблюдений в группах 1.1. и 1.2 диагностирована разница в выраженности воспалительных и регенераторных процессов в послеоперационном периоде. Так, на глазах после фоторефракционной кератоабляции с рибофлавином все вышеперечисленные реакции проходили заметно менее выраженно, о чем свидетельствуют среднебальные оценки всех экспериментальных животных из обеих групп, что, в свою очередь, не может не свидетельствовать о фотопротекторных свойствах рибофлавина, которые подтверждаются данными литературы [39, 46, 57, 65].

    Для оценки упруго-прочностных свойств образцов роговиц кроликов при эксимерлазерной абляции без и с предварительным насыщением стромы раствором рибофлавина в экспериментах ex vivo и in vivo были исследованы образцы роговиц 42 глаз кроликов. В экспериментах ex vivo (32 глаза 16 кроликов) глаза были также разделены на две группы: группа 2.1 – контрольная (нативные образцы роговиц); группа 2.2 – исследуемая, где абляция выполнялась на глубину 100 мкм в режиме ФТК; группа 2.3 в экспериментах in vivo (10 глаз 10 кроликов) – трансФРК с глубиной абляции 50 мкм соответственно. Тензиометрические испытания проводились на установке Zwick/Roell ВZ 2.5 /TN1S (Германия). Исследования проводились на базе лаборатории химии и технологии материалов для сердечно-сосудистой хирургии в ФГБНУ «НЦССХ им. А.Н. Бакулева» (Москва). При оценке биомеханических свойств аблированных образцов роговиц глаз экспериментальных животных, предварительно насыщенных рибофлавином, было отмечено повышение их упруго-прочностных свойств по сравнению с аналогичными образцами, на которых абляция проводилась без насыщения рибофлавином. Оценивались такие свойства, как прочность при растяжении, сила на разрыв и модуль упругости (модуль Юнга).

    На примере экспериментов ex vivo, было выявлено статистически значимое увеличение прочности при растяжении – 7,2±1,6 мПа у образцов, аблированных на глубину 100 мкм с предварительным насыщением стромы раствором рибофлавина, против 5,1±1,4 мПа у образцов, аблированных на глубину 100 мкм без предварительного насыщения стромы раствором рибофлавина (р=0,0011). При оценке результатов эксперимента iv vivo данная тенденция подтвердилась: 12,8±1,3 мПа у образцов, аблированных с предварительным насыщением раствором рибофлавина, против 8,8±0,9 мПа у образцов, аблированных без предварительного насыщения (p=0,0004). При этом, показатель прочности при растяжении у образцов из контрольной группы составил 5,1±0,6 мПа.

    При анализе максимальной силы при разрыве также выявлено статистически значимое увеличение : 12,0±2,8 Н у образцов, аблированных на глубину 100 мкм с предварительным насыщением стромы раствором рибофлавина, против 8,7±2,5 Н у образцов, аблированных на глубину 100 мкм без предварительного насыщения стромы раствором рибофлавина (р=0,005). При оценке результатов эксперимента iv vivo: 18,3±1,2 Н у образцов, аблированных с предварительным насыщением раствором рибофлавина, против 12,8±1,6 Н у образцов, аблированных без предварительного насыщения (p=0,0004). При этом, показатель максимальной силы при разрыве у образцов из контрольной группы составил 19,2±2,1 Н.

    Стоит отметить обнаруженную достоверную разницу между показателями модуля упругости (модуль Юнга), в случае абляции без и с предварительным насыщением стромы роговицы раствором рибофлавина, в экспериментах ex vivo: 0,9±0,4 Н/мм² у образцов, аблированных с рибофлавином против 0,5±0,2 Н/мм² у образцов после абляции без предварительного насыщения стромы рибофлавином (р=0,016); и ее отсутствие в экспериментах in vivo: 1,0±0,3 Н/мм² у образцов, аблированных с рибофлавином и 0,9±0,2 Н/мм² у образцов после абляции без рибофлавина (р=0,7). При этом, показатель модуля упругости в контрольной группе составил 0,9±0,5 Н/мм² .

    Как показали экспериментальные исследования, абляция стромы роговицы глаз кролика на глубину 100 мкм является избыточной для данного вида животного (в нашем случае, кролик породы шиншилла). В результате чего возникает ярко выраженная асептическая воспалительно-регенераторная реакция, в ходе которой происходят необратимые морфофункциональные изменения в глубжележащих слоях роговицы. Однако данные исследования позволили выявить значительное повышение упруго-прочностных свойств образцов роговиц после проведения абляции на глубину 100 мкм.

    Вышеизложенное позволяет сделать вывод о том, что абляция пропитанной раствором рибофлавина роговицы кролика на указанную глубину приводит к возникновению изменений в глубжележащих слоях стромы, схожих с теми, которые образуются после проведения процедуры кросслинкинга по «классической» методике [108, 177, 233, 258, 261]. В то же время вопрос о целесообразности столь значительного увеличения упруго-прочностных свойств роговицы остается открытым. Как известно, модуль упругости (модуль Юнга) является основным критерием определения тензиометрических характеристик роговицы при стандартной технологии кросслинкинга [258, 261]. И при «классической» методике кросслинкинга, увеличение модуля упругости (модуль Юнга) может достигать 200-300%, включая при этом все негативные аспекты процедуры в целом [169, 193, 204].

    Результаты экспериментов in vivo показали достижение исходных (в случае максимальной силы при разрыве), либо слегка превосходящих исходные (в случае прочности при растяжении), прочностных свойств, при этом упругость («жесткость») роговицы (модуль Юнга) остается на исходном, либо близко к исходному, уровне.

    Таким образом, разработанная технология, избавляет роговицу от нежелательной УФ-нагрузки, в случае необходимости проведения процедуры кросслинкинга по стандартному, либо ускоренному протоколу с целью предотвращения развития осложнений в послеоперационном периоде, что нивелирует тот ущерб, который обычно наносится роговице на клеточном и функциональном уровне во время процедуры кросслинкинга [165, 212], а наличие достоверного увеличения максимальной силы при разрыве и прочности при растяжении, а также отсутствие достоверной разницы в показателях модуля упругости (модуля Юнга) в экспериментах in vivo указывает на физиологичность предложенной технологии лазер-индуцированного кросслинкинга.

    Для определения влияния насыщения стромы раствором рибофлавина на скорость и точность абляции до и после ее проведения в экспериментах ex vivo была выполнена ультразвуковая кератопахиметрия, а также оптическая когерентная томография роговицы – группы 2.2 и 2.3 (32 глаза 32 кроликов).

    Средняя толщина роговиц до абляции составила 472±24 мкм; после дозированной абляции на глубину 100 мкм и без предварительного насыщения стромы раствором рибофлавина – 382 ±28 мкм; после дозированной абляции на глубину 100 мкм с предварительным насыщением стромы роговицы раствором рибофлавина – 373 ±29 мкм. Таким образом, влияния раствора рибофлавина на скорость и точность абляции выявлено не было (p >0,05).

    Для оценки морфологических изменений после лазериндуцированного кросслинкинга при эксимерлазерной абляции с рибофлавином объектом исследования служили препараты роговиц глаз 12 кроликов, прижизненно подвергнутые эксимерлазерной абляции на глубину 50 мкм без и с предварительным насыщением стромы изотоническим 0,25% раствором рибофлавина группы 3.1 и 3.2 (12 кроликов, 12 глаз). Патоморфологическое исследование проводилось по истечение 1, 3 и 7 суток.

    Сравнение образцов роговиц после трансФРК без и с предварительным насыщением стромы рибофлавином привело к следующим результатам: абляция в обоих вариантах проведена эффективно, на одинаковую глубину. Воспалительная инфильтрация сильнее выражена на глазах после абляции с рибофлавином. Однако признаки воспаления при этом дольше персистируют на глазах после абляции без рибофлавина. Аналогично в обоих вариантах наблюдается незначительно утолщение роговицы за счет отека наружных слоев стромы роговицы, который спадал к 3-му дню. Эпителизация роговицы эффективнее и активнее протекает на глазах после трансФРК с рибофлавином. Во всех образцах происходит активация кератоцитов и изменения в неклеточной части стромы в проекции абляции, при этом качество коллагеновых волокон разное: в случаях после трансФРК без рибофлавина волокна более регулярные, тогда как на глазах после трансФРК с рибофлавином отмечаются короткие разнонаправленные волокна; строма близ зоны абляции построена нерегулярно, что может быть морфологическим отражением процесса кросслинкинга коллагена под воздействием вторичного УФ-лазерного излучения, которое довольно подробно описано и в литературе [188, 233, 262, 266].

    В свою очередь, анализ ультраструктурных изменений 4 образцов роговиц (группы 4.1 и 4.2), по данным трансмиссионной электронной микроскопии, также показал, что после проведения трансэпителиальной ФРК с предварительным насыщением стромы изотоническим раствором рибофлавина наблюдаются изменения, свойственные кросслинкингу (такие как: укрупнение волокон и пучков коллагена; образование новообразованных пучков коллагена; увеличение компактности упаковки волокон за счет количества поперечных сшивок), что также подтверждается данными литературы [258, 266]. По результатам комплексной морфологической оценки, посредством световой и трансмиссионной электронной микроскопии, установлено, что роговица в ходе фоторефракционной кератоабляции с предварительным насыщением стромы раствором рибофлавина подвержена изменениям, соответствующим крослинкингу.

    Таким образом, проведенные экспериментальные исследования показали, что вторичное излучение, индуцируемое в ходе абляции, может быть использовано для эффекта кросслинкинга коллагена стромы роговицы, при ее насыщении 0,25% изотоническим раствором рибофлавина, а лазериндуцированный кросслинкинг может рассматриваться как альтернативный щадящий вариант технологии кросслинкинга роговицы в фоторефракционной хирургии. Предварительное насыщение стромы роговицы раствором рибофлавина также оказывает фотопротекторный эффект, что благоприятно сказывается на скорости эпителизации и снижает ответную воспалительно-регенераторную реакцию в послеоперационном периоде.