Заключение

    В связи с необходимостью создания оптимального способа внутрироговичной коррекции дефектов радужной оболочки была сформулирована цель настоящего исследования – разработка и обоснование в эксперименте технологии коррекции дефектов радужной оболочки методом внутрироговичного искусственного диафрагмирования с применением нового гелевого окрашенного имплантата.

    Для достижения поставленной цели работа была разделена на 5 этапов, соответствующих задачам исследования, которые включали в себя:

    определение светопропускаемости новых гелевых окрашенных имплантатов для оценки их функционального диафрагмирующего эффекта на основании проведения спектрофотометрии;

    изучение реакции культуры кератоцитов и стромы роговицы в эксперименте in vitro на образцы новых гелевых окрашенных имплантатов на основании методов двухмерного клеточного культивирования и органотипического культивирования;

    изучение реакции стромы роговицы экспериментального животного на имплантацию предложенных образцов гелевых окрашенных имплантатов на основании биомиокроскопии и световой микроскопии;

    определение возможности стабильного положения гелевого окрашенного имплантата в роговичном туннеле на основании эксперимента на кадаверных глазах (ex vivo);

    разработку оптимизированной хирургической методики внутрироговичного искусственного диафрагмирования с фемтосекундным лазерным сопровождением с использованием программного обеспечения для формирования новой формы реза для входа в роговичный туннель в эксперименте ex vivo;

    Первым этапом работы являлось проведение спектрофотометрии для оценки светопропускаемости образцов гелевых окрашенных имплантатов и определения их функционального диафрагмирующего эффекта.

    На анализ были предоставлены 3 образца исследуемых гелеобразных окрашенных имплантатов.

    Образец 1 – Натрия гиалуронат + органический пигмент Cromophtal Brown.

    Образец 2 – Гидролизат коллагена + краситель с неорганическим пигментом.

    Образец 3 – ГПМЦ + органический пигмент Cromophtal Brown.

    Спектрофотометрический анализ проводился на приборе NanoVue Plus (GE Healthcare, США). Данный капельный (плёночный) спектрофотометр имеет однолучевую оптическую схему и работает в режиме пропускания.

    Для образцов на основе метилцеллюлозы и гиалуроновой кислоты с органическим пигментом было характерно наименьшее пропускание (соотв. и наибольшее поглощение) излучения в диапазоне 500 — 700 нм, т. е. видимой части спектра.

    Для образца на основе гидролизата коллагена с неорганическим пигментом не удалось провести измерения, ни в режиме сканирования (200 — 950 нм), ни в одноволновом режиме (200 — 1100 нм, с шагом 100 нм), т. к. светочувствительный элемент (детектор) спектрофотометра не регистрировал достаточное количество фотонов (т. е. уровень пропускаемого образцом излучения был ниже предела детектирования прибора). В литературных источниках подобная информация не была обнаружена в связи с тем, что углубленное изучение физических свойств внурироговичного гелевого окрашенного имплантата на основе гидролизата коллагена и неорганического пигмента производится впервые в рамках данного диссертационного исследования.

    Полученный результат говорит о полном отсутствии пропускания света, а значит, о хороших диафрагмирующих свойствах гелевого окрашенного имплантата на основе гидролизата коллагена и неорганического пигмента, что является важным для оценки пригодности окрашенного имплантата к использованию в клинической практике. Гелевые окрашенные имплантаты с большей светопропускаемостью могут быть рассмотрены для проведения кератопигментации с косметической целью. Результаты проведения спектрофотометрического анализа и сформированные выводы предопределили дальнейшую актуальность изучения биологического действия каждого образца разработанных имплантатов.

    Была проведена серия экспериментально-морфологических исследований, при этом биологическое действие образцов на основе гиалуроната натрия, гидролизата коллагена и метилцеллюлозы была изучена на клеточной культуре (in vitro), на глазах экспериментальных животных (in vivo), и кадаверных глазных яблоках (ex vivo).

    Второй этап – органотипическое и двухмерное клеточное культивирование (экспериментально-морфологическое исследование in vitro).

    Эксперимент проводился на 12 роговицах, полученных из Глазного тканевого банка и непригодных для трансплантации. В 9 из них были имплантированы разработанные гелеобразные окрашенные имплантаты (разный состав), а 3 роговицы составили контрольную группу. Роговицы культивировали в течение 7 суток, затем оценивали выраженность тканевой реакции по степени покрытия поверхностей клеточными элементами методами флуоресцентной микроскопии и сканирующей электронной микроскопии. По окончании исследования было отмечено, что оптимальные результаты показал образец №2 по следующим критериям: слабая экспрессия инициаторных белков апоптоза Caspasa 8 и Цитохром С, отсутствие экспрессии ВАХ и эффекторных белков Caspasa 3/7. По данным электронносканирующей микроскопии было выявлено, что образцы №1 и №3 подвергаются частичному растворению и вымыванию из интрастромального кармана, образец №2 имеет плотную структуру и сохраняется в роговичном кармане на всем протяжение культивирования, как минимум 7 суток.

    Согласно результатам проведенных исследований in vitro, биосовместимость разработанного имплантата на основе гидролизата коллагена и неорганического пигмента была выше, чем у имплантатов на основе метилцеллюлозы и гиалуроновой кислоты. Полученные результаты сопоставимы с литературными данными [59].

    Третий этап работы – экспериментально-морфологическое исследование in vivo. Экспериментально-морфологическое исследование in vivo включало 20 животных, которых после хирургического вмешательства наблюдали в течение 3 месяцев.

    В ходе проведенного исследования было показано, что разработанные имплантаты при введении не вызвали выраженной воспалительной реакции глаза кролика, визуализируемой биомикроскопически, и имели стабильное положение в сформированном внутрироговичном тоннеле. Наблюдали распыление пигмента с легким «флёром» в случае образца № 3 на основе метилцеллюлозы и органического пигмента, что сопоставимо с результатом исследования на глазах экспериментального животного, где биомикроскопически на 2 из 5 глазах зафиксировано неравномерное распределение цвета.

    Образец № 2 на основе гидролизата коллагена и неорганического пигмента показал себя оптимальным по состоянию канала и отсутствию инфильтрации краской окружающей стромы, что позволяет считать его наиболее перспективным для применения в клинических условиях.

    Полученные в ходе работы результаты не противоречили литературным данным [59]. В современной офтальмологии при проведении кератопигментации чаще всего используются пигменты на органической и неорганической основе (оксиды металлов) [55,109].

    По данным литературы, зарубежные офтальмологи использовали при проведении кератопигментации как органический, так и неорганический пигмент. При использовании органического пигмента в клинической практике у пациентов осложнений отмечено не было, но через 3-6 месяцев отмечалось побледнение и частичное вымывание пигмента [119]. При использовании неорганического пигмента (в составе 50% оксида железа) на экспериментальных животных было отмечено 2 случая воспаления и минимального отека, который разрешился в течение 2 недель после операции.

    Ни одного случая изменения цвета пигмента обнаружено не было [109].

    Полученные результаты и возможность определения образца, обладающего оптимальными свойствами, предопределили необходимость дальнейшего исследования и создания хирургической методики проведения фемтолазерной кератопигментации.

    Четвертый этап работы – эксперимент на кадаверных глазах, по результатам которого было выявлено, что образец №2 продемонстрировал стабильность нахождения в строме роговицы и четкую фиксацию пигмента, но некоторое количество гелевого имплантата вытекало интраоперационно в процессе введения его в роговичный туннель, что обосновало необходимость дальнейшего изучения технических особенностей операции и решения последующих задач диссертационной работы.

    Завершающим пятым этапом диссертационной работы явилась оптимизация технологии внутрироговичного искусственного диафрагмирования с использованием гелевого окрашенного имплантата и фемтосекундного лазера.

    На сегодняшний день в офтальмохирургии для проведения оперативных вмешательств на роговице и для формирования роговичного тоннеля существуют различные фемтолазеры и их программы.

    При выполнении четвертого (предыдущего) этапа работы стало очевидно, что стандартная форма реза (прямой вертикальный рез) для входа в роговичный туннель является несовершенной в случае выполнения кератопигментации, так как рез указанной формы практически не препятствует выходу гелеобразного окрашенного имплантата наружу и не обеспечивает его стабильной фиксации, следовательно, достижение необходимого диафрагмирующего эффекта будет невозможным. Именно поэтому оптимизация способа хирургической коррекции дефектов радужной оболочки, отличающегося проведением внутрироговичной фемтолазерной кератопигментации с формированием одного интрастромального туннеля и выполнением самогерметизирующегося роговичного реза для входа в туннель, представлялась актуальным вопросом заключительного этапа диссертационной работы.

    Для создания эффекта самогерметизации входа в роговичный туннель на базе компании ООО «Оптосистемы» разработано программное обеспечение «Фемто Визум: Роговичный туннель» для фемтосекундного лазера Фемто Визум. Используемые в работы параметры фемтосекундного лазера: частота лазера 100 кГц-10 МГц; скорость перемещения пучка 5-200 мм/с; энергия в импульсе 0.1 – 3 мкДж.

    Самогерметизирующийся роговичный рез для входа в интрастромальный туннель выполняется тангенциально-ориентированным и может быть выполнен как с одним изломом, так и с двумя, а также двумя пересекающимися надрезами, или он выполняется радиальноориентированным - двумя пересекающимися надрезами.

    Для подтверждения эффективности разработанного программного обеспечения был проведен эксперимент на кадаверных глазах (n=10).

    Учитывая полученные в предыдущих главах положительные результаты оценки диафрагмирующих свойств и биосовместимости, для интрастромального введения использовался образец №2 на основе гидролизата коллагена и неорганического пигмента.

    В ходе эксперимента с формированием тангенциальноориентированного входа в интрастромальный туннель с одним изломом (n=4) вытекание имплантата наружу в процессе его введения не наблюдалось ни в одном случае.

    При выполнении эксперимента с формированием тангенциальноориентированного двунаправленного входа в интрастромальный туннель «ступенькой» с двумя изломами (n=4) вытекание имплантата наружу в процессе его введения наблюдалось в 3 из 4 случаях.

    При формировании других возможных форм реза в большинстве случаев наблюдалось вытекание гелевого окрашенного имплантата. При выполнении тангенциально-ориентированного «зигзагообразного» входа в интрастромальный туннель с двумя изломами (n=4) вытекание имплантата наружу в процессе его введения наблюдалось в 3 из 4 случаях. При создании тангенциально-ориентированного (n=4) и радиально-ориентированного (n=4) входов в интрастромальный туннель, выполненных двумя пересекающимися надрезами, вытекание имплантата наружу в процессе его введения наблюдалось во всех случаях.

    Заявленный технический результат достигается за счет того, что сформированный самогерметизирующийся роговичный рез для входа в интрастромальный туннель препятствует миграции, выходу и потере красящего вещества, тем самым обеспечивая стабильную фиксацию краски в туннеле, и, как следствие, достаточный диафрагмирующий эффект. В открытых литературных источниках аналогичная информация не была обнаружена в связи с тем, что создание специального программного обеспечения с формированием оригинальной формы реза для входа в роговичный туннель с целью выполнения кератопигментации произведено впервые в рамках данного диссертационного исследования.

    Таким образом, проведенное доклиническое исследование разработанного внутрироговичного гелеобразного окрашенного имплантата на основе гидролизата коллагена и неорганического пигмента подтверждает его высокую биосовместимость, разработанная композиция может быть рекомендована к дальнейшему изучению. Учитывая социальную значимость проблемы и большое количество пациентов, нуждающихся в малоинвазивной хирургической помощи при аниридии, представленная технология коррекции дефектов радужной оболочки методом внутрироговичного искусственного диафрамирования является перспективной для дальнейшего изучения безопасности и эффективности ее применения в клинических условиях.