Заключение

    Ожоговая травма глаза является одним из наиболее тяжелых и прогностически неблагоприятных его поражений как по характеру изменений в тканях, так и по исходам. Единственно возможным методом восстановления зрения у таких пациентов остается кератопротезирование [9, 15, 24]. Однако, существующие в настоящее время модели кератопротезов, как правило, не обеспечивают истинного приживления в тканях роговицы, в связи с качеством материалов и развитием асептического некроза [5, 6].

    Анализ истории кератопротезирования позволил отразить прямую зависимость частоты асептического некроза от конструкции кератопротеза. Большинство авторов видят решение проблемы в сращении опорной части кератопротеза в результате клеточной инвазии и врастании волокон роговицы в материал кератопротеза [68, 93, 133]. Таким образом, актуальной представляется разработка и изготовление новой модели кератопротеза, обладающей высокими оптическими характеристиками и способной надежно интегрироваться в ткани роговицы.

    Наиболее часто в настоящее время кератопротезы имплантируют в интрастромальный карман в глубокие слои роговицы. Для облегчения приживления кератопротеза в роговице ряд авторов предлагает использовать синтетические полимерные материалы [72, 94, 133]. Влияние полимера на биологические ткани определяется свойствами поверхности полимерного материала, точнее величиной его свободной поверхностной энергии.

    Декомпенсация межмолекулярных сил в поверхностном слое является причиной отсутствия адгезии и адсорбции. На основании исследований по изучению поверхностных свойств полимеров, минимальная клеточная адгезия наблюдается на материалах, обладающих высокой гидрофильностью и низкими значениями свободной поверхностной энергии [38, 89]. Изучив многолетний экспериментальный и клинический опыт различных авторов в использовании синтетических материалов для изготовления кератопротезов и учитывая требования, предъявляемые к кератопротезированию, для изготовления кератопротеза был выбран полимерный материал - пространственно сшитый гидрофобный акрил.

    С учетом вышесказанного целью работы явилось: экспериментально-морфологическое обоснование новой конструкции кератопротеза с позиции выбора оптимального материала и дизайна для его опорной пластины. Для достижения поставленной цели работа была разделена на 5 этапов соответствующих задачам исследования, которые включали в себя расчет геометрических параметров ОПК, на основе изучения физических аспектов, математического моделирования с учетом анатомо-топографических особенностей роговицы; изучение клеточной реакции на полимерную ОПК на основании двухмерного клеточного культивирования in vitro; изучение степени интеграции и фиксации ОПК на модели донорской роговицы человека посредством клеточной инвазии ex vivo; изучение в условиях in vivo влияния модели ОПК на форму передней и задней поверхностей роговицы экспериментального животного, в сравнении с опорным элементом, выполненным из титана; изучение реакции стромы роговицы экспериментального животного на имплантацию новой модели кератопротеза.

    Так, на первом этапе необходимо было провести математическое обоснование оптимизации дизайна полимерной периферической части кератопротеза - диаметра, радиуса кривизны, толщины ОПК, размера ослабляющих отверстий, характеристики жесткости, а также глубины залегания, с учетом анатомо-топографических особенностей роговицы человека и подтвердить эффективность рассчитанных параметров в условиях эксперимента.

    В работах [8, 16, 33] определяли коэффициенты снижения жесткости густоперфорированной пластины при ее изгибе. Размеры отверстий разработанной ОПК составляют десятки микрометров поэтому у данной модели возможно проявление свойств нанопластины с рядом характерных размеров порядка нанометров. В настоящее время учеными активно обсуждаются вопросы наномеханики и нанотехнологий. Основные характеристики и функциональные свойства достаточно малых систем начинают зависеть от размера частиц - эффект, который нельзя наблюдать в объемных материалах или у более крупных частиц. При переходе к нанообъектам и нановеществам наблюдается связи между их размерами и физико-химическими свойствами.

    В связи с влиянием характерных размеров на функциональность компонентов и их свойства У. Хартманн в своей монографии [35] приводит следующее определение: «Специфические функциональные параметры в нанотехнологиях достигаются путем связи между соответствующими свойствами уменьшением характерных структурных размеров в тех случаях, когда размеры объектов (по крайней мере, в двух измерениях) не превышают значения 100 нм».

    В нанотехнологиях особую ценность приобретают свойства материала на поверхности структуры, поскольку в некоторых случаях весь объект может быть представлен в виде особой «поверхности». При этом поверхностные области материала по своим свойствам начинают существенно отличаться от физико-механических характеристик внутри материала. Cоответственно, для систем с размерами более 100 нм, справедливы классические законы физики [98, 120]. Дальнейшее уменьшение масштабов структур и явлений требует учета квантово-механических эффектов и связанных с ними особенностей. В работе [12] показано, что при числе атомарных слоев более 8 изгибная жесткость материала перестает зависеть от межатомарных связей, и стремится к значению классической теории упругости, что имеет место в ОПК. Ввиду этого, при исследовании механических свойств ОПК применяли классические методы биомеханики.

    Согласно формуле зависимости коэффициента снижения жесткости ОПК r от величины пористости материала расчет геометрических параметров ОПК позволил получить значение минимально достаточной жесткости ОПК равной 0,036 Н/мм² . При меньших значениях относительно минимально достаточной жесткости вероятность изгиба краев ОПК велика. Выпуклая форма опорной пластины гарантирует высокую изгибную жесткость при достаточно больших значениях радиуса кривизны. Сферическая форма ОПК является геометрически несгибаемой. Геометрическая несгибаемость сферической формы поверхности для ОПК означает, что при равномерной нагрузке форма ОПК не изменится и занимает стабильное положение. По данным сравнительного математического анализа новая модель ОПК имеет имеет большее значение жесткости, чем модель "Сеточка" и меньшее, чем модель Федорова-Зуева поэтому для ее сферичности требуются меньшие усилия, чем для жесткого элемента. Следовательно, это может привести к уменьшению количества некрозов над краем опорного элемента.

    Полученные параметры в ходе математического моделирования, позволили спроектировать новую модель кератопротеза. Дальнейшее подтверждение эффективности данной модели было проведено в условиях эксперимента.

    Вторым этапом работы было запланировано проведение экспериментально-морфологического исследования in vitro. Для постановки эксперимента было изготовлено 8 образцов, исследуемых ОПК двух моделей сферической формы диаметром 4 мм с радиусом кривизны 8,0 мм и толщиной 100 мкм. Модель ОПК №1 представлена в виде пластины сетчатой структуры со сквозными квадратными отверстиями (200х200 мкм). Модель ОПК №2 представляет собой пластину сетчатой структуры со сквозными отверстиями трапециевидной формы и изменяющейся величины от периферии к центру (от 170х130 мкм до 180х70 мкм). Стоит отметить, что в зарубежной литературе представлены материалы экспериментальных исследований по разработке кератопротезов из пористых полимеров на основе гидрофобных материалов [134]. Исследования развивались в поиске материалов от жесткого гидрофобного материала, таких как пластмассы и каучуки, до гидрогелей, синтетических гомополимеров, сополимеров, биополимеров [86] и, наконец, взаимопроникающих полимерных сетей [98, 107]. По мнению авторов, использование кератопротезов из полимерных материалов с ячеистой структурой позволяет фиксировать их интрастромально и не прерывать питание поверхностных слоев роговицы, что снижает риск отторжения кератопротеза в результате асептического некроза ткани [108,124,125,135].

    При проведении 2D культивирования клеток стромы роговицы человека в присутствии различных моделей ОПК оценивали биологическую совместимость с культурой клеток стромы роговицы человека на основании пролиферации клеток и адгезии к материалу ОПК. В каждой из экспериментальных групп отмечали тенденцию к планомерному увеличению количества клеток от 1-х к 9-ым суткам наблюдения, что подтверждало сохранение пролиферативной активности и способность КСР к адгезии к поверхности ОПК в обеих группах по данным конфокальной лазерно-сканирующей микроскопии. На основании полученных результатов сделали вывод о биосовместимости исследуемых моделей ОПК. Ожидаемым результатом явилось доказательство нетоксичной природы различных моделей ОПК, что подтвердило потенциальную пригодность для интрастромальной имплантации, однако требовалось дальнейшее изучение данных изделий в условиях ex vivo на модели кадаверной роговицы человека с целью выявления наиболее подходящей модели. Стоит отметить, что полученные результаты были сопоставимы с имеющимися литературными данными, подтверждающими нетоксичность материала, а так же показали потенциальную пригодность использования полимера на основе гидрофобного акрила для интрастромальной имплантации [42, 57].

    Третий этап – экспериментально-морфологическое исследование ex vivo в условиях органотипического культивирования роговиц кадаверных глаз было направлено на изучение тканевой реактивности кадаверной роговицы человека в ответ на имплантацию разработанных ОПК в условиях органного культивирования методами конфокальной и сканирующей электронной микроскопии, а также оценки структурных изменений материала ОПК. В эксперимент вошло 12 роговиц кадаверных глаз, в которые были имплантированы разработанные ОПК. Роговицы культивировали в течение 90 дней в стандартной ростовой среде в условиях нормотермии. В опытную группу №1 (n=4) вошли роговицы кадаверных глаз, в строму которых имплантировали ОПК сетчатой структуры со сквозными квадратными отверстиями (200х200 мкм), во 2-ой опытной группе (n=4) имплантировали ОПК сетчатой структуры со сквозными отверстиями трапециевидной формы и изменяющейся величины от периферии к центру (от 170х130 мкм до 180х70 мкм). В контрольной группе (n=4) проводили формирование роговичного тоннеля без имплантации ОПК. В ходе экспериментального исследования через 90 суток по данным сканирующей электронной микроскопии было отмечено более выраженное формирование грубой соединительнотканной капсулы вокруг ОПК в группе №1 с ячейками одинакового размера. Для определения деградации материала до и после выполнения органотипического культивирования экспериментальные образцы ОПК фотографировали. После выведения образцов ОПК из эксперимента структура их поверхности и форма не изменилась, что позволило исключить биодеградируемую природу материала. Полученные данные соответствовали данным проведенного двумерного клеточного культивирования в присутствии исследуемых ОПК различных моделей, а кроме того, позволили впервые исследовать клеточно-тканевую реакцию роговицы кадаверного глаза на присутствие в строме исследуемых моделей ОПК.

    Для подтверждения полученных результатов исследования биосовместимости на моделях in vitro и ex vivo были проведены клинические исследования in vivo на экспериментальных животных в количестве 15 кроликов, которые были разделены на 3 равные группы. В качестве контрольной группы был выбран кератопротез Федорова-Зуева, так как данная модель долгое время являлась единственно используемой в клинической практике на территории Российской Федерации. Наблюдение выполняли в течение 90 дней, далее всех животных выводили из эксперимента, проводили эксплантацию ОПК с последующим морфологическим исследованием методами световой и сканирующей электронной микроскопии. В каждой группе наблюдение проводили в сроки 1, 3, 7, 14, 30 и 90 дней с выполнением биомикроскопии и оптической когерентной томографии роговицы с фоторегистрацией.

    В ходе проведенного исследования было показано, что разработанные ОПК при имплантации не вызывали выраженной воспалительной реакции глаза кролика, визуализируемой биомикроскопически и офтальмоскопически, занимали стабильное положение в сформированном ИСК. На сроке наблюдения 90 дней в группе 2 (2 глаза) наблюдали помутнение и язвенный дефект передних отделов роговицы над ОПК и протрузию у 1 кролика (1 глаз) в группе 1 на 30 сутки.

    Протрузия ОПК, наблюдаемая в 1 группе, вероятно, была связана с имплантацией в поверхностные слои стромы на глубину менее 160 мкм. При этом протрузия ОПК во 2 группе, вероятно, была обусловлена нарушением питания роговицы в области безъячеистой структуры ОПК, а также уменьшением размера ячеек к центру, с последующей потерей ее прозрачности и развитием асептического некроза, что было подтверждено результатами исследования на оптическом когерентном томографе.

    На сроке наблюдения 90 дней после эксплантации ОПК по результатам световой микроскопии во всех случаях в проекции, располагавшейся ранее ОПК, визуализировали полость в строме центральных отделов, повторяющую ячеистую форму протеза. Роговица была эпителизирована не полностью, в строме передних отделов отмечали умеренный отек, в задних отделах патологических изменений выявлено не было. При этом в группе 1 визуализировали полость в строме с фрагментами капсулообразования, в группе 2 элементы капсулы в полости отсутствовали. Стоит отметить, что данные световой микроскопии совпадали с результатами электронно-микроскопических исследований. На поверхности ОПК 1-ой опытной группы наблюдали наличие новообразованной коллагеновой волокнистой ткани, заполняющей ячейки полимерной пластины в более выраженной степени, в отличие от 2-ой опытной и контрольной группы.

    Стоит отметить, что в доступной зарубежной литературе найдены работы, посвященные разработке полимерных кератопротезов на основе гидрофобного акрила. Wolfgang Muller-Lierheim (2008 г.) и соавторы изучали биосовместимость кератопротеза на моделях 8 глаз кроликов в течение 3-х месяцев. С целью повышения адгезивных свойств материала использовали покрытие из фибронектина. В своей публикации авторы описывают течение послеоперационного периода в ранние и отдаленные сроки наблюдения и не отмечают развития выраженной воспалительной реакции, предложенная модель кератопротеза занимала стабильное положение. Однако по результатам гистологического исследования только в 2-х случаях разработанный кератопротез был прочно интегрирован в роговицу кроликов без признаков воспаления [92, 125].

    Завершающим этапом диссертационной работы явилось конструирование новой модели кератопротеза из гидрофобного акрила на основе модели ОПК 1-ой опытной группы сетчатой структуры со сквозными квадратными отверстиями (200х200 мкм) толщиной 100 мкм и диаметром 8 мм. В центре опорной пластины располагается оптический цилиндр с оптической силой 14,5 D, диаметром 4мм, длина его наружной части 0, 1 мм, внутренней – 0,05 мм. В ходе выполнения экспериментально-морфологического исследования in vivo на экспериментальных животных в количестве 7 кроликов. Также на основании сопоставления результатов морфологических и клинико-инструментальных методов исследований проводили наблюдение в течение 3 месяцев. В большинстве случаев воспалительная реакция глаза отсутствовала (в 6 из 7). По данным световой микроскопии отмечено равномерное распределение коллагеновых волокон в области передней поверхности разработанного кератопротеза и истончения эпителия роговицы, которое, происходит ввиду увеличения натяжения слоев стромы роговицы, вызванного наличием кератопротеза, однако, с учетом особенностей строения роговицы экспериментального животного (кролика) и их отличий от роговицы человека, полученные данные могут иметь некоторые отличия при использовании данной модели в клинической работе [106, 108, 109]. Также отмечено врастание волокон новообразованной соединительной ткани в ячеистую структуру опорного элемента, плотно фиксируя кератопротез, что исключает его смещение в слоях роговицы и относительно оптической оси глаза.

    Таким образом, с учетом результатов математического моделирования, физических аспектов и анатомо-топографических особенностей роговицы были разработаны ОПК различного дизайна, изготовленные из полимерного материала на основе гидрофобного акрила. На основании экспериментально-морфологических исследований доказана высокая степень адгезии клеток к моделям, по выраженности которой можно говорить о биосовместимости. В 1-ой опытной группе реакция со стороны стромы роговицы и прорастание волокнами соединительной ткани было больше, что обусловлено пористым строением изделий и физическими свойствами данного материала.

    Проанализировав данные проведенных исследований на моделях in vitro, ex vivo и in vivo можно сделать общее заключение: выполненное экспериментальное исследование модели кератопротеза из нового эластичного гидрофобного полимера подтверждает его высокую биосовместимость, во всех случаях были получены позитивные результаты.

    В результате сложилось однозначное мнение о целесообразности его дальнейшего изучения в клинических условиях.