Заключение

    Настоящее исследование посвящено разработке способа укрепления тканей роговицы после тяжелой ожоговой травмы. Данное направление весьма актуально в современном кератопротезировании, так как, несмотря на многократные попытки создания «идеального кератопротеза», решить проблему протрузии в долгосрочной перспективе, сохранив при этом удовлетворительные зрительные функции не удаётся [27, 152, 61, 164, 168].

    По всей видимости, решение этой задачи лежит в комплексном подходе, подразумевающем совершенствование самих протезов и разработку мер профилактики, в основе которых лежит создание устойчивой и механически прочной ткани. И, если путь совершенствования кератопротезов напрямую зависит от эволюции материалов их изготовления и в данный момент находится в некотором «ожидании», то в таком направлении, как укрепление роговицы, открыты новые горизонты благодаря активно развивающейся регенеративной медицине.

    Предлагаемый нами подход кардинально отличается от имеющихся на сегодняшний день способов укрепления бельм. В отличие от классических методов с применением аутологичных тканей, мы пытаемся перестроить бельмо в более плотную и механически устойчивую структуру благодаря собственным механизмам клеточной регенерации. Такой подход возможен благодаря применению сигнальных молекул – факторов роста. Стоит отметить, что такой подход ранее не применялся в офтальмо логии, поэтому за основу, в качестве ориентира, были взяты работы смежных специальностей, в частности, травматологии и стоматологии, а также исследования в области биологии, клеточной инженерии и другие [80, 97, 109, 134, 116, 166, 185]. Разработка способа укрепления тканей роговицы с использованием факторов роста виделась нам целесообразной и вполне выполнимой и в офтальмологии, однако требовала объемного изучения.

    Цель исследования – обосновать в эксперименте применение коллагенового имплантата, содержащего фактор роста rhBMP-2, с целью улучшения биомеханических и трофических характеристик ткани роговицы и её бельма.

    Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи:

    1. Провести комплексное исследование биологических эффектов фактора роста rhBMP-2 на культуре клеток in vitro, а также оценить его системное влияние на иммунную систему в эксперименте in vivo.

    2. Оценить возможность использования коллагена как носителя для доставки rhBMP-2 в ткань роговицы с подбором оптимальной концентрации, обеспечивающей максимальный период полувыведения этого фактора роста в окружающие ткани.

    3. Исследовать клинические и морфологические эффекты rhBMP-2 в составе коллагенового носителя при его введении в строму роговицы и ткань бельма.

    4. Отработать хирургическую методику интрастромального введения rhBMP-2 в составе носителя на роговице экспериментальных животных, а также адаптировать операцию к условиям кератопротезирования.

    5. Изучить изменения биомеханических свойств нативной роговицы и ожогового бельма экспериментальных животных после интрастромального введения фактора роста rhBMP-2.

    Учитывая сложность и нетривиальность поставленных задач, мы уделили особое внимание методике построения эксперимента. Сначала был проведен комплекс исследований in vitro на культуре клеток роговицы кролика. Данные исследования были направлены на:

    - оценку влияния фактора роста и носителя на культуру клеток;

    - выбор оптимального количества фактора роста для введения в строму роговицы;

    - исследование возможности контролируемого высвобождения фактора роста из носителя.

    После обработки полученных in vitro результатов проводились серии экспериментов in vivo. На 40 крысах-самцах породы wistar исследовался местный иммунный ответ путём подкожной имплантации носителя с фактором роста предварительно иммунизированным животным.

    Следующим этапом проводились две серии экспериментов in vivo на кроликах породы шиншила, самцах весои 3-3,5 кг и возрастом 6 месяцев. В первой серии изучалась принципиальная возможность повышения механических характеристик роговицы с использованием rhBMP-2 в составе коллагенового носителя, а также фиксировались полученные биологические эффекты. Эксперимент на нативной роговице позволил нам эффективно наблюдать за динамически меняющейся клинической картиной, так как ткани изначально были прозрачными и хорошо доступны для визуального осмотра.

    Во второй серии эксперимента мы попытались приблизить будущую методику к реалиям кератопротезирования, для чего поставили эксперимент на ожоговых бельмах роговицы кроликов. Отработали возможный вариант операции по введению имплантата в строму ожогового бельма и сравнили полученные результаты с первой серией эксперимента. Такой подход обеспечивает всесторонний и пошаговый процесс изучения проблемы.

    Общий план работы выглядел следующим образом:

    - анализ вопроса о выборе фактора роста и типе носителя для его доставки в ткани роговицы;

    - оценка воздействия выбранного фактора и носителя на культуру клеток в эксперименте in vitro;

    - исследование возможности контролируемого высвобождения фактора роста из носителя;

    - оценка влияния на организм (иммунный ответ);

    - проведение серии экспериментов по введению имплантата в строму роговицы и бельма in vivo;

    - оценка биомеханических характеристик тканей.

    Обращаясь к вопросу выбора фактора роста, нельзя не остановиться на типах тканей, наиболее хорошо зарекомендовавших себя в качестве материалов для укрепления бельм. По нашему мнению, которое также совпадает с мнением большинства авторов, хрящевая ткань наиболее актуальна на сегодняшний день. Её свойства удовлетворяют требованиям хирургии, она устойчива к ишемии и обладает достаточной прочностью. В тоже время, по данным литературы, добиться наименьшего числа протрузий удается в методике остеодентокератопротезирования, где используется костная ткань [192]. Таким образом, логично взять за основу наиболее эффективные на данный момент методики и обратить внимание на материалы, в них применяемые – костную и хрящевую ткани.

    На этапе теоретического изучения было выяснено, что существует целое семейство факторов роста, отвечающих за регенерацию костной и хрящевой ткани, также способных индуцировать хондро- и остеогенез. Это семейство трансформирующего фактора роста, которое включает в себя группу белков, именуемых BMP (bone morphogenic proteins). На данный момент, известно порядка 28 видов BMP, однако в клинической практике разрешены к применению rhBMP-2 и rhBMP-5. Нас привлекла хорошая изученность rhBMP-2, многофакторность его действия и, что немаловажно, наличие отечественных аналогов, не уступающих известным зарубежным компаниям [17], значительно удешевляющих затраты на исследование. Данный фактор роста обладает всеми необходимыми свойствами (разрешен для клинического применения, хорошо изучен в смежных офтальмологии специальностях, доступен) для планирования и проведения экспериментальной работы с его использованием, а отсутствие подобных исследований в офтальмологии подчеркивает актуальность этого исследования.

    Эксперимент in vitro продемонстрировал принципиальную возможность применения rhBMP-2 для использования в роговичной хирургии. Это подтверждается на всех этапах эксперимента отсутствием цитотоксичности по отношению к клеткам роговицы кролика, что было подтверждено окрашиванием на витальные красители.

    Добавление в питательную среду rhBMP-2 в объеме 30 мкг не оказывает цитотоксичного эффекта на клетки стромы роговицы кролика и способствует пролиферации. Меньшие концентрации 1 и 10 мкг тоже не оказывают токсического воздействия, но малоэффективны относительно пролиферативной активности клеток. Концентрация 50 мкг также не оказывает цитотоксического эффекта, однако соотношение живых и мертвых клеток было незначительно хуже в сравнении с 30 мкг при схожем уровне пролиферации. Таким образом, наиболее приемлемая концентрация rhBMP-2 для введения в строму роговицы была определена – 30 мкг белка.

    Несмотря на то, что в литературе имеются данные о действии фактора на пролиферацию клеток, в своем исследовании выраженного эффекта на клетки нормальной роговицы мы не отмечали. Это можно объяснить тем, что в условиях in vitro фактор роста не способен оказывать полноценного эффекта в силу своего механизма действия, включающего более сложную, многоступенчатую и взаимосвязанную последовательность биологических реакций и клеточных взаимоотношений. К тому же выяснилось, что клетки стромы роговицы не являются таргетными для rhBMP-2. Это подтверждается нашими последующими результатами экспериментов in vivo, где чётко видно образование новых структур (таких как сосуды и молодая соединительная ткань), указывающих на высокую пролиферативную активность клеток, мигрирующих в строму в ответ на стимулы со стороны фактора.

    Применение rhBMP-2 в чистом виде сильно ограничено, для достижения клинического эффекта необходимо создать и поддерживать минимальную концентрацию в течение длительного времени. При этом необходимо обеспечить локальность его применения, иначе есть риск вовлечения нетаргетных тканей и возможно развитие осложнений [33, 69, 185].

    Анализ литературы показал, что основным носителем для rhBMP-2 является коллаген. Это объясняется тем, что он имеет общие домены связывания с данным фактором роста [99], а фибриллярная структура коллагена способна к его диффузному удерживанию [108]. Всё это обеспечивает большую эффективность в сравнении с синтетическими материалами. Дело в том, что ключевой идеей применения носителей для доставки факторов роста является то, что в идеале имплантируемый материал, интегрируясь с окружающими тканями, возьмет на себя основные функции поврежденных тканей и будет постепенно деградировать со скоростью, наилучшим образом соответствующей естественному уровню клеточной дифференцировки и пролиферации, постепенно замещаясь тканями в ответ на стимулы со стороны факторов роста. Свойства тканей существенно различаются во всем организме, поэтому для достижения этой цели дизайн носителя должен быть максимально специфичным (химически и биомеханически) для типа ткани-мишени [151, 165, 206]. Коллаген более специфичен для роговичной ткани на фоне других природных и синтетических полимеров [134, 138]. В связи с чем, его применение видится нам наиболее оптимальным.

    Подобные носители разрабатывались в основном для соответствующих условий применения в травматологии и стоматологии. В офтальмологии же такой носитель отсутствует, а готовые решения из смежных специальностей не подходят в силу своей неадаптированности к условиям офтальмологии и роговичной хирургии, в частности. Например, использование коллагеновой губки крайне затруднительно в плане имплантации в интрастромальный карман роговицы, а также способности удерживать швы. Отличительной особенностью применяемого коллагена в нашей работе является его высокая концентрация и нативная структура, что позволяет связывать и удерживать ещё большее количество белка в меньшем объеме (и соответственно меньшем размере) носителя, что очень важно для таких структур глазного яблока, как роговица.

    Полученные в результате экспериментов данные показывают, что разработанный нами носитель, обогащенный rhBMP-2 в объеме 30 мкг, способен поддерживать минимально возможную действующую концентрацию (1,5 мкг) данного белка на протяжении 28 дней в зоне имплантации. Отдельно хочется отметить, что количество BMP-2, рекомендуемое к введению человеку, составляет от 400 до 1200 мкг фактора роста [22]. Количество фактора, которое мы применяли для воздействия на роговицу кролика, было минимальным (всего лишь 30 мкг) по сравнению с тем количеством, которое применяется в клинической практике. Добиться этого удалось благодаря связыванию rhBMP-2 с нативным коллагеном на этапе изготовления имплантатов, а не пропитыванию коллагеновых губок непосредственно перед вмешательством.

    Особое внимание заслуживают результаты исследования системного иммунного ответа. В результате определения титра антител к rhBMP-2 в сыворотках крови крыс методом иммунно-ферментного анализа, было установлено, что при введении коллагенового имплантата с rhBMP-2 под кожу экспериментальных животных, уровень антител в крови не превышает фоновых значений на всех сроках наблюдения (до 28 дней). Что позволяет сделать вывод, что то количество rhBMP-2, которое высвобождается из коллагенового носителя, не оказывает системного иммунного ответа, а это создает почти неограниченные возможности для использования данного подхода.

    Результатом проведенных экспериментов стало создание коллагенового имплантата с заданными характеристиками: диаметром 12 мм, толщиной 0,1 мм и содержанием rhBMP-2 30 мкг. Следует отметить, что разработанный коллагеновый имплантат является абсолютно биосовместимым материалом, который не вызывает нежелательных побочных реакций в окружающих тканях. Это позволило перейти к проведению серии экспериментов на животных, главной задачей которых явилась оценка возможности работоспособности предполагаемой концепции. А именно перестройки собственных тканей бельма и нативной роговицы в более прочную и механически устойчивую ткань.

    Для этого было проведено две серии экспериментов in vivo, первая включала изучение воздействия на ткани нативной роговицы, а вторая – непосредственно на бельма. Мы старались максимально уделить внимание объективности и стандартизации экспериментов. Для этого использовались кролики одной породы, возраста и пола, а именно самцы породы шиншила, весом 3-3,5 кг и возрастом 6 месяцев. Порода шиншила выбрана нами из-за наличия хорошо пигментированной радужной оболочки у её представителей, что значительно упрощает визуальный контроль при фоторегистрации и визуально помогает при проведение операции. В послеоперационном периоде применялась стандартная схема лечения с использованием одинаковых препаратов в равном количестве (инстиллировали окомистин (Miramistin) по 1 капле 3 раза в день). Для исключения риска самопроизвольного травмирования оперированного глаза и занесения инфекции, кроликам одевали специальные воротники (см. главу 2). Разработанная схема имплантации носителя с фактором роста была максимально приближена к реальным операциям, во всех случаях была задействована вся площадь роговицы. Размер и состав носителя, а также количество фактора роста было идентично в обеих сериях экспериментов. Животные выводились на одинаковых, заранее запланированных сроках наблюдения (1, 3, 6 и 9 месяцев).

    Результаты первой серии экспериментов показали, что используемый нами коллагеновый носитель в чистом виде (без фактора роста) биосовместим и сохраняет прозрачность, что соотносится с данными литературы [32, 108, 134, 52], а обогащенный rhBMP-2 оказывает выраженное воздействие на неоангиогенез, вызывает отёк тканей в раннем послеоперационном периоде и привлекает множество клеток в место введения. Данные результаты были ожидаемы, т.к. в литературе хорошо описаны эффекты rhBMP-2 [69, 75, 76, 77, 101, 207, 107]. Явным положительным эффектом явилось увеличение механической прочности и упругости роговицы. Отдельного внимания заслуживает методика исследования биомеханики.

    Для оценки биомеханических свойств роговицы был проанализирован ряд схожих работ и используемых в них методик. Наиболее распространенным методом определения биомеханических свойств явилось исследования прочности тканей на разрыв. Однако при анализе существующей литературы мы обратили внимание на сильный разброс в результатах таких исследований. Дело в том, что данная методика идеально подходит для оценки ровных и твердых однородных материалов, в то время как роговица имеет кривизну и слоистую структуру. Фиксация роговицы подобным образом приводит к образованию двух противоположных сил: на внешней стороне напряжения сжатия и на внутренней – напряжение растяжения, что способствует образованию множества микроскладок, расположение которых всегда различно. К тому же, данный метод не позволяет давать оценку механическим свойствам всей роговицы в целом, а при изучении слоистых тканей (как в случае с роговицей, строма которой содержит другой материал) вызывает эффект «выдавливания» внутренних слоев на поверхность, сближающимися стенками внешних слоёв при растяжении. Указанное вносит дополнительный разброс в результаты, так как этот процесс, как и в случае с микроскладками, всегда различен. К тому же, очень важное значение имеет длительность разрывного стимула: очевидно, что чем он длиннее, тем более точные данные мы получим. Однако конструктивные особенности такого исследования не позволяют применять длительные воздействия на живые ткани в силу их высыхания на воздухе.

    По этой причине нами была поставлена задача получить максимально объективные данные по биомеханике, учитывая вышеперечисленные сложности. Добиться этого позволило исследование прочности тканей на прокол. Суть этого исследования состоит в том, что цельная роговица фиксируется в специально разработанном зажиме за склеру, на роговице отмечается оптический центр и данная конструкция погружается в физиологический раствор. Затем, отмеченный центр роговицы совмещается с датчиком, который опускается до момента прокола тканей и позволяет оценивать не только максимальную нагрузку, но и эластичность исследуемых образцов, что имеет важное значение в функциональных результатах кератопротезирования.

    Образцы роговиц экспериментальных животных в первой серии эксперимента показали прогрессирующее увеличение прочностных характеристик. В ходе эксперимента удалось повысить прочность ожогового бельма роговицы более чем в 4 раза по сравнению со здоровой нативной тканью, и данная тенденция имела место к дальнейшей прогрессии. Причина повышения прочности, по всей видимости, заключается в контракции коллагенового носителя и окружающих его тканей, сопровождающееся увеличением плотности коллагеновых волокон. Подобный механизм описан в следующих работах [76, 150, 206, 209, 210]. Оценка изменения толщины роговицы и гистологическое исследование позволили подтвердить эту мысль.

    Наше исследование показало, что после имплантации носителя с фактором роста в строму роговицы в первом месяце наблюдаются отёк и повышенная клеточность, затем отёк спадает и толщина роговицы начинает постепенно уменьшаться. В течение последующих 3 месяцев эта динамика сохраняется, однако наблюдается постепенная стабилизация процесса и к 6 месяцам наблюдения можно говорить о её окончании. Процесс постепенного уменьшения исходной толщины тканей четко коррелирует с нарастанием прочностных характеристик роговицы. Однако надо учесть тот факт, что за весь срок наблюдения (6 месяцев) ни в одном из случаев толщина роговицы не вернулась к исходным значениям, и всегда оставалась выше, что по нашему мнению, можно трактовать как положительный эффект, т.к. зачастую кератопротезированию подвергаются истонченные бельма, нуждающиеся в утолщении. Данный эффект объясняется образованием соединительной ткани и подтверждается гистологическим исследованием.

    Гистологическое исследование позволило подтвердить наблюдаемые клинические эффекты, главным образом заключающиеся в выраженной неоваскуляризации и образовании соединительной ткани, на препаратах 1-го месяца наблюдения (накопление экссудата и повышенную клеточность), а также минимальные признаки воспаления на всех сроках эксперимента.

    Выраженный неоангиогенез вызывал опасения, т.к. в теории мог приводить к развитию неоваскулярной глаукомы. Однако гистологические срезы цилиарных отростков, радужки и угла передней камеры позволили убедиться в безопасности метода, тем самым подтвердив локальность воздействия фактора роста за счёт применения удачной системы доставки, в основе которой лежит коллаген, подтвердив правильность нашего выбора на этапе планирования и анализа существующей литературы. Выраженная неоваскуляризация оказывает положительное трофическое действие на ткани бельма и, по всей видимости, может трактоваться позитивно.

    Интересным открытием, хотя и «лежащим на поверхности», явилось повышение механических свойств тканей роговицы и бельма при использовании чистого коллагенового имплантата без фактора роста. Это связано с естественными процессами перешивки коллагеновых волокон.

    Проанализировав полученные данные, убедившись в положительных для кератопротезирования эффектах, оказываемых на нативные ткани роговицы, мы перешли ко второй серии экспериментов по отработке данного способа на модели ожогового бельма роговицы кролика.

    В силу отсутствия прозрачности и малой исходной толщины бельма (в среднем 380 мкм) операцию по введению имплантата в строму пришлось адаптировать под соответствующие условия.

    Отдельного внимания заслуживает методика создания модели ожогового бельма у экспериментальных животных. Проанализировав существующую литературу, мы решили использовать методику, предложенную Ченцовой Е.В. (1996), суть которой заключалась в аппликации хлопчатобумажного диска, пропитанного 10% NaOH, на роговицу кролика в течение 10 секунд. Однако нами было обнаружено, что данной модели не хватает гибкости, в частности, не учитывается количество находящегося NaOH в аппликационном диске, а также короткий период воздействия, сочетающийся с высокой концентрацией щелочи, делают методику лёгкой для передозировки. На предварительных пробных экспериментах нами было замечено, что увеличение времени аппликации на 1-2 секунды может приводить к превышению разрушающего воздействия щелочи и развитию десцеметоцеле через 2-3 недели. С другой стороны, слишком раннее удаление приводит к недостаточной травме и возможен регресс бельма к 6 месяцам наблюдения. Поэтому мы решили использовать меньшую концентрацию NaOH (3%) и увеличить время воздействия щелочи на ткани до 30 секунд. При таком подходе погрешность в 1-2 секунды не оказывала столь значимого клинического эффекта, и полученные бельма были более стандартизированы. Количество NaOH всегда было одинаковое, т.к. мы пропитывали диск из хлопчатобумажной ткани всегда равным объемом щелочи – 0,2 мл. При таком объеме, аппликационный диск полностью впитывал NaOH, и в модели участвовало одинаковое количество щелочи для всех глаз.

    Проведенные эксперименты на бельмах показали схожие результаты с первой серией, отличительной чертой явилось более быстрое нарастание эффектов rhBMP-2, что объясняется исходно повышенной активностью биологических процессов, протекающих в сосудистом бельме. Что в целом было ожидаемо. Важно подчеркнуть исходную низкую прочность бельма и наличие в нём хронического воспаления, несмотря на то, что итоговая прочность становилась сопоставима и даже превышала показатели экспериментов на роговице. Указанное делает предлагаемую нами методику акцентированной на укрепление бельм, т.к. используемый rhBMP-2 имеет больше возможностей для взаимодействия с клетками. Изначальный потенциал высвобожденного фактора роста не расходуется в «ожидании» неоваскуляризации и притока большого числа клеток. К тому же, в подобных условиях, помутнение роговицы, вызываемое фактором роста, не оценивается как негативное воздействие.

    Таким образом, удалось доказать эффективность применения предлагаемого способа и в условиях ожогового бельма, что даёт почву для дальнейших исследований и проведения клинических испытаний.

    Данный подход, по нашему мнению, позволит приблизиться к решению тяжелой проблемы, а именно профилактики протрузии кератопротезов. Существующие на данный момент способы, среди которых наибольшее распространение получили методики с использованием аутологичных тканей человека: это укрепление бельма аутонадкостницей большеберцовой кости, фасцией височной мышцы, слизистой оболочкой полости рта, аутохрящом ушной раковины, аутотеноновой капсулой, перикардом и т.д. [4, 21, 22] имеют ряд ограничений, таких как, часто возникающий недостаток аутологичных тканей, невозможность формирования равномерного трансплантата с заданными характеристиками и дополнительные операции по забору тканей.

    Предложенный способ не сравнивался с существующими методиками в плане эффективности и, по всей видимости, это будет целью дальнейших исследований, однако уже сейчас можно с уверенностью говорить о перспективности данного подхода, лишенного вышеперечисленных недостатков и доказательно увеличивающего прочностные характеристики бельма.