Заключение

    Увеальная меланома (УМ) – наиболее частая злокачественная опухоль сосудистой оболочки глаза у взрослых, представляющая угрозу не только зрению и глазу, но и жизни пациента [3, 8, 213, 224]. Лечение УМ к настоящему времени достигло высоких показателей эффективности и развивается в сторону все большего распространения органосохраняющих методов [20, 24, 26, 33, 46, 163, 216]. Тем не менее, после успешного лечения внутриглазного очага у пациентов с УМ сохраняется существенный риск развития отдаленных МТС, который составляет 35–50% в течение 10 лет и не зависит от метода лечения первичной опухоли [141, 149]. Существенное увеличение выживаемости может быть достигнуто, в том числе, при комплексном лечении пациентов с единичными метастатическими очагами небольшого размера [11, 12, 58]. Соответственно, наиболее актуальными направлениями клинических исследований при УМ в настоящее время являются поиск методов раннего выявления небольших метастатических очагов и разработка эффективной адъювантной терапии [94]. Для обоих этих направлений критически важен адекватный отбор пациентов с высоким риском развития МТС. Среди широкого круга прогностически значимых факторов особое значение придается молекулярным нарушениям, определение которых возможно лишь на материале опухоли. При этом имеющаяся органосохраняющая направленность в лечении УМ [24, 79, 106, 136, 173, 195], в частности широкое применение лучевых методов, требует получения материала опухоли без ее полного удаления или удаления глаза, что диктует необходимость проведения биопсии УМ. Забор опухоли может проводиться методом ТИАБ.

    Несмотря на имеющуюся 30-летнюю историю ТИАБ, целостная технология манипуляции отсутствует [36, 61, 144, 165, 181, 194]. С одной стороны, современные потребности офтальмологии диктуют необходимость разработки микроинвазивной и безопасной техники забора опухолевой ткани, с другой – онкологические тенденции определяют важность получения объемного материала, пригодного для мультимаркерных исследований. Таким образом, основными составляющими задачами в формировании целостной современной технологии ТИАБ внутриглазных образований, в частности УМ с прогностической целью, является разработка инструментария и техники ТИАБ, позволяющих получить достаточную для исследований опухолевую ткань, определение методов профилактики возможных осложнений биопсии, сохранение и обработка полученного материала, а также разработка прогностической панели наиболее значимых для выживаемости пациентов с УМ морфологичексих и генетических маркеров, использование которых целесообразно в рамках ТИАБ.

    Для выполнения поставленных задач с целью разработки целостной современной технологии биопсии внутриглазных образований на экспериментальном этапе использовали энуклеированные глаза (n=71) с клинически установленным диагнозом УМ. Впоследствии технология была апробирована в клинике при проведении диагностической биопсии у 48 пациентов.

    Был определен оптимальный инструментарий, необходимый для проведения ТИАБ. На сегодняшний день ТИАБ выполняется инъекционными стерильными иглами 25G, 27G [61, 104, 144, 200]. Их использование в собственной практике на начальном этапе разработки технологии, а также имеющиеся литературные данные, показали, что основными недостатками таких игл являются малый просвет, а также фиксированный острый (9-13°) угол заточки рабочего конца иглы. Это обуславливает не только малое количество получаемого материала, но и неполное погружение острия иглы в ткань опухоли и выстояние верхней части аспирирующего окна над поверхностью сетчатки, что является причиной аспирации стекловидного тела и сетчатки в процессе биопсии. Разработанные в рамках исследования биопсийные иглы позволили решить эту проблему (Патент РФ №2020109301). При сохранении калибра иглы удалось увеличить просвет ее трубки на 0,2 мм и 0,13 мм для игл 25G и 27G, соответственно. Предложенные схемы подбора угла заточки биопсийных игл в зависимости от проминенции опухолевого очага обеспечили тангенциальный вход в опухоль острия иглы, целесообразность которого усматривал еще Augsburger с соавт. в 1984г. [36] Это позволило получить информативный материал при биопсии опухолей малой проминенции - от 1,7мм до 3мм - в 100% случаев, что значительно превосходит представленные в литературе показатели информативности, свидетельствующие о пригодности материала ТИАБ образований высотой до 3 мм лишь в 30-40% случаев [61, 144, 209].

    Еще один вид разработанных игл 25-27G с прорезью на противоположной острию части трубки (Патент РФ № 2672476) позволил повысить объем получаемого материала благодаря увеличению площади аспирирующего окна и заточенным кромкам прорези, отсекающими при ротационном движении иглы ткани внутриглазного образования. Это минимизирует риск получения неинформативного материала при биопсии больших опухолей, имеющих такие морфо-анатомические особенности строения как плотность и высокая когезивность клеток [37, 87].

    Таким образом, предложенные иглы являются первыми специализированными иглами для проведения ТИАБ внутриглазных образований, эффективность которых была доказана в эксперименте, а также при последующем проведении диагностической ТИАБ у 48 пациентов. Полезность использования трубки-проводника, позволяющей более тонко проводить манипуляцию, было также подтверждено в рамках исследования, в отличие от подхода отечественных авторов [7], при котором шприц соединен непосредственно с иглой.

    ТИАБ новообразований заднего полюса проводится двумя доступами – транссклеральным и трансвитреальным. При этом выбор доступа, как правило, зависит от локализации очага, что ранее не всегда учитывалось [7]. Нами было показано, что оптимальной при постэкваториальной локализации образования является трансвитреальная ТИАБ, при преэкваториальной – транссклеральная, особенно в случаях, подразумевающих одномоментное проведение брахитерапии, предотвращающей возможный рост опухоли по склеральному каналу [45, 117, 231]. Проведенная в одном случае транскорнеальная ТИАБ, не описанная ранее в литературе, может использоваться в селективных случаях цилиохориоидальных образований при отсутствии удовлетворительного мидриаза.

    В процессе апробации предложенной методики ТИАБ в клинической практике было показано, что экваториальные, а также преэкваториальные очаги возможно пунктировать транвитреально благодаря фиксации оптического блока микроскопа, имеющего три степени свободы, под любым углом относительно глаза. Трансвитреальная ТИАБ оказалась более предпочтительной – во всех 15 случаях преэкваториального расположения очагов в группе диагностической ТИАБ (n=48) использован доступ через pars plana. При этом, по данным литературы [182], такой доступ используется лишь в 7% случаев опухолей цилиарного тела и передних отделов хориоидеи.

    Основанием этому явилось удобство выполнения манипуляции, визуализация процесса забора опухоли, а также возможность контроля места пункции склеры в отсроченном периоде, что исключено при проведении транссклеральной ТИАБ. При этом предположения о предпочтительности трансвитреальной ТИАБ высказывались и ранее – так, Ben J. Glasgow и соавт. (1998г) [102] сообщали, что использование трансвитреальной техники в меньшей мере ассоциировано с имплантацией опухолевых клеток в склеральный канал, чем использование транссклеральной. Это, вероятно, обусловлено формированием склерального канала в основании опухоли. Преимущественное использование трансвитреального доступа также объясняется результатами проведенного в рамках работы экспериментом, показавшими возможность заноса опухолевых клеток биопсийной иглой в склеральный канал. При этом имеющиеся литературные данные о возможной склеральной имплантации клеток УМ при ТИАБ [102, 143, 176] с последующим ятрогенным экстрабульбарным ростом опухоли ставили под сомнение безопасность и трансвитреального доступа.

    В связи с этим впервые был разработан метод профилактики такого осложнения ТИАБ, значительно повышающий ее локальную безопасность. Выполнение биопсии через витреоретинальный порт позволяет исключить контакт иглы с оболочками глаза, как потенциального «переносчика» клеток опухоли. Полученные экспериментальные данные при проведении ТИАБ на энуклеированных глазах свидетельствуют о том, что количество случаев имплантации опухолевых клеток в склеральный канал (n=5) оказалось статистически выше при ТИАБ, выполняемых непосредственно через склеру, чем при ТИАБ, выполняемой через порт (р=0,018). Дополнительным подтверждением этому, косвенно указывающим на необходимость установки витреоретинальных портов при проведении ТИАБ, стали две независимые работы, появившиеся параллельно с проведением данного исследования. В первой Singh с соавт. (2017г) [210] сообщают о наличии клеток УМ в просвете портов, извлеченных после проведения ТИАБ, что является свидетельством возможности переноса клеток биопсийной иглой, во второй – Kim с соавт.(2017г) [128] не обнаружили клеток УМ в склеральных трактах при установке порта на 18 глазах (при этом ТИАБ без порта не проводилась). При этом установка витреоретинального порта перед ТИАБ в ряде случаев позволила решить проблему появления умеренной гипотонии при извлечении иглы из глаза, обусловленной выходом жидкой части стекловидного тела. В таких случаях утраченный объем возмещали путем подачи сбалансированного раствора BSS через порт. При избыточном нагнетании жидкости в полость глаза также осуществляли ее сброс через порт.

    На сегодняшний день в мировой литературе методики ТИАБ не содержат способов борьбы с интраоперационным кровотечением, которое, по данным литературы, возникает в 2% случаев. Для решения данной проблемы нами был предложен способ (Патент№ 2698448), заключающийся в установке дополнительного витреоретинального порта диаметром от 25G до 27G для подачи через него жидкости – сбалансированного раствора BSS – до создания умеренной кратковременной офтальмогипертензии, которая способствовала компрессии поврежденных и неполноценных сосудов опухоли. Упоминание в ряде работ о «надавливании» на зону склеротомии ватной палочкой может свидетельствовать о попытке создания авторами офтальмогипертензии, возможно, с целью предотвращения кровотечения [190]. Кроме того, нами было отмечено, что повышение внутриглазного давления создает условия для большего продвижения опухолевых масс в свободное пространство (просвет иглы), сокращая время, затрачиваемое на манипуляцию, и повышая информативность ТИАБ.

    Для повышения информативности ТИАБ, кроме разработки инструментария и техники выполнения манипуляции, нами был предложен путь более рационального использования получаемого материала. Вопреки имеющимся данным отечественных авторов об успешности ТИАБ методом «сухого шприца» [7], стандартным, по данным литературы, является забор опухолевой ткани в жидкостную среду с последующим выделением клеток, например, при помощи фильтров [87, 190, 207, 211]. Впервые в рамках нашей работы было предложено использовать не только клеточный осадок путем фиксации его на стекла, но и супернатант, оставшийся после первичной обработки материала ТИАБ. Супернатант, как показал проведенный эксперимент, оказался пригодным для выделения ДНК и проведения молекулярных тестов in vitro (методами Супер-АС-ПЦР-РВ и ПЦР с последующим секвенированием продуктов ПЦР). Тестирование парных образцов на драйверные мутации – материала ТИАБ и собственно опухоли, ТИАБ которой выполнялась, - показало, что данный метод обработки материала может быть использован в клинической практике. Так, информативность составила 100%, чувствительность - 95%. Цитологическое исследование стеклопрепаратов также подтвердило эффективность как всей технологии, так и данного метода обработки материала в частности: информативность составила 100%, чувствительность – 97%. Такой подход в использовании биопсийного материала позволил определять присутствие эпителиоидных или веретеновидных клеток УМ (чувствительность-ХХ%), что ранее, по данным литературы, не проводилось. Причиной этого, по-видимому, являлась «экономия» биопсийного материала и использование его только для генетического исследования. Игнорирование при прогностической ТИАБ, по данным литературы, цитологического анализа в случае клинически установленной УМ является причиной потери одного важнейшего морфологического прогностического фактора – клеточного типа УМ[83, 140, 162, 179, 180, 184, 201].

    Разработанные инструментарий для проведения манипуляции и техника забора опухолевой ткани, а также предложенный способ обработки биопсийного материала позволили достичь информативности у пациентов при проведении диагностической ТИАБ на уровне 98%. При этом высота опухолей различного генеза варьировалась от 1,72мм до 15,4мм. Полученные нами данные информативности значительно превосходят имеющиеся в литературе: так, информативность при биопсии опухолей даже средних размеров (проминенцией от 3мм до 5,5мм), соответствующих стадии Т2, не превышает 65-78% [37, 182]. При этом большой размер очага не исключает возможность получения неинформативного материала, что также было решено в процессе разработки технологии ТИАБ, о чем было сказано ранее.

    Следующим этапом для достижения поставленной цели - разработки целостной современной технологии ТИАБ, в т.ч. прогностической, – явился поиск морфологических и генетических маркеров, определяющих метастатический потенциал УМ. Это, в свою очередь, должно стать основанием для разработки прогностической панели маркеров, определяющих риск развития метастатического потенциала УМ.

    Как уже было сказано, прогностическая эффективность имеющихся прогностических классификаций [55, 90, 142, 148, 170, 215, 228] остается на относительно низком уровне, что объясняется рядом противоречий в исследованиях, несогласованности результатов, а также широким и разрозненным спектром генетических нарушений, входящих в прогностические классификации. Для оценки влияния генетических и морфологических факторов на развитие МТС УМ была прослежена судьба 96 пациентов в сроки до 15 лет, которым была проведена энуклеация по поводу УМ. Пациенты были разделены на две группы в зависимости от наличия или отсутствия МТС. При этом пациенты без МТС не имели признаков диссеминации опухоли при сроке наблюдения свыше 3 лет. Пациенты были стандартизированы по основным клиническим факторам риска: по возрасту, размеру УМ, локализации, вовлечению в процесс цилиарного тела и экстрабульбарному росту. Впервые был проведен сравнительный анализ встречаемости различных маркеров в однородных группах пациентов с МТС и без МТС, определено влияние каждого изменения на выживаемость пациентов с УМ.

    Единственной морфологической особенностью опухоли, определение которой возможно в рамках цитологического исследования, является клеточный тип. В рамках настоящего исследования было показано, что наличие эпителиоидноклеточного компонента в опухоли в два раза чаще встречается у пациентов с МТС УМ (р<0,0001), а также негативно сказывается на выживаемости (р<0,001). Так, 3- и 5-летнюю выживаемость при веретеноклеточном типе УМ определяли на уровне 70%, при наличии эпителиоидного компонента - 40% и 25%, соответственно. Свидетельства связи повышенного риска развития МТС с эпителиоидноклеточным типом УМ широко представлены в литературе [3, 83, 123, 140, 162, 179, 180, 184].

    При этом смешанноклеточная УМ относится исследователями к «промежуточному», с точки зрения прогноза, клеточному типу. Нами с достоверностью было показано, что присутствие эпителиоидных клеток в опухоли является предиктивно неблагоприятным. Это позволяет в случае выявления в материале ТИАБ округлых клеток УМ расценивать ее как опухоль, обладающую высоким метастатическим потенциалом.

    Оценку генетических факторов прогноза впервые в отечественной практике осуществляли методом мультиплексной амплификации лигированных зондов (MLPA). Мутационный анализ проводили по двум направлениям – анализ мутаций-«драйверов» и анализ мутаций-«модификаторов».

    Анализ на «драйверные» мутации в генах GNAQ и GNA11 выявил встречаемость данных нарушений в 93% случаев, что соответствует данным литературы. Несмотря на имеющиеся единичные отечественные публикации, свидетельствующие о встречаемости мутаций двух генов одновременно [19], нами, как и абсолютным большинством зарубежных исследователей [75, 81, 133, 169], было показано, что данные нарушения являются взаимоисключающими. Таким образом, молекулярно-генетическая верификация диагноза УМ путем анализа «драйверных» мутаций генов GNA11 и GNAQ обладает крайне высокой чувствительностью и может быть использована как дополнительный метод дифференциальной диагностики, в частности, при неоднозначной морфологической картине или при небольшом количестве материала, что имеет особое значение при проведении диагностической ТИАБ при подозрении на УМ.

    Вопреки имеющимся данным литературы, свидетельствующим об отсутствии связи мутаций-«драйверов» и развитии МТС [19, 44, 133], сравнение групп пациентов с МТС и без МТС показал, что в первой группе почти в два раза чаще встречается мутация c.626A>T, p.(Gln209Leu) в экзоне 5 гена GNA11 (р=0,02). Анализ выживаемости пациентов с УМ в зависимости от наличия мутаций генов GNA11 и GNAQ подтвердил лишь связь мутации c.626A>T, p.(Gln209Leu) в экзоне 5 гена GNA11 с повышением риска развития МТС у пациентов с УМ при сроках наблюдения свыше 2 лет (р=0,03).

    Мутации в «горячих точках» гена EIF1AX, выявленные в 18% случаев, достоверно чаще встречались в группе пациентов без МТС при сроках наблюдения свыше 3 лет (р<0,0001). При этом мутация гена EIF1AX была выявлена у одного пациента с признаками диссеминации опухоли, что ранее в литературе описано не было. Несмотря на относительно невысокую частоту определения мутации в «горячих точках» гена EIF1AX, которую авторы оценивают на схожем уровне в 8-21% [82, 91], по нашим данным, ее выявление в опухолевой ДНК сопряжено с достоверно более высоким уровнем выживаемости (р<0,0001). Так, 3- и 5-летняя выживаемость пациентов с данной мутацией определена на уровне 94%, тогда как для пациентов без нее выживаемость составила 49% и 35%, соответственно. Это подтверждает имеющиеся предположения о наличии «защитных» свойств данного нарушения [76, 82, 91, 99, 142, 150, 228]. При этом мутации гена EIF1AX и ВАР1 являются, по данным литературы, взаимоисключающими [172]. Это не нашло подтверждения в нашей работе – был впервые выявлен один случай такого сочетания, которое у пациента без МТС может косвенно указывать на приоритетное благоприятное «действие» мутации гена EIF1AX.

    Частота выявления мутации в экзоне 14 гена SF3B1 составила 8% -аналогичные результаты были представлены другими авторами [76, 142, 175]. При этом нами не было отмечено какой-либо связи данной мутации с наличием или отсутствием МТС (р=1,0). Кроме того, имеющиеся данные о встречаемости мутации гена SF3B1 у пациентов молодого возраста, а также о развитии МТС в более поздние сроки – в среднем через 8 лет [33, 48, 93, 222] – не нашли подтверждения в нашем исследовании: уровень выживаемости пациентов с мутацией и без нее не имел статистически значимых различий (р=0,8).

    Впервые в рамках цитогенетического тестирования нами проведен поиск всех известных хромосомных нарушений, характерных для УМ, на материале одной выборки. На возможную прогностическую значимость исследовали 8 маркеров – нарушения копийности регионов 1p, 3p, 3q, 6p, 6q, 8p и 8q, а также гена BAP1.

    Анализ короткого плеча хромосомы 1 показал, что достоверная разница в распределении нарушений в группах пациентов с МТС и без МТС отсутствует (р=0,4). При этом нами было выявлено отсутствие статистически значимой разницы между выживаемостью пациентов с делецией и нормой, что противоречит имеющимся данным зарубежных исследователей [90, 114, 126]: так, уровень 3- и 5-летней выживаемости, по данным Ewens K.G. c соавт.(2013г) [90], при делеции региона 1р составляет 50% и 38%, соответственно, при нормальном его статусе - 85% и 70%. Нами же было доказано, что наименьший уровень 3- и 5- летней выживаемости, составляющий 24%, сопряжен с амплификацией, в том числе субклональной (р=0,009). По нашим сведениям, полученные результаты являются первым свидетельством негативного влияния такого нарушения на прогноз у пациентов с УМ.

    Анализ хромосомы 3 проводили по двум направлениям – исследовали количество копий короткого (3р) и длинного плеч (3q). Делецию и субклональную делецию региона 3р выявляли в 56% случаях в группе ретроспективного анализа, что соответствует данным Prescher с соавт. (1996г) [54] , которые также в 56% выявляли момносомию хромосомы 3 на материале 54 энуклеированных глаз. Работа Shields CL с соавт. (2011г), посвященная анализу 500 образцов УМ методом FISH, сообщает о встречаемости моносомии 3 хромосомы лишь в 25% [194]. Еще 27% приходится на частичную моносомию хромосомы 3, которую авторы расценивают как эквивалент дисомии: 3-летний уровень метастазирования составляет 2,6% и 5,3% при дисомии и частичной моносомии, соответственно. Нами же было показано, что субклональная делеция региона 3р достоверно (р=0,001) в два раза чаще встречается у пациентов с МТС УМ. При этом выживаемость при субклональной делеции соответствовала таковой при делеции (р=1,0) и определялась на уровне 49% и 31% для 3-х и 5-ти лет, соответственно. Таким образом, это нарушение не позволяет его отнести к норме, как это было предложено Shields CL с соавт. (2011г) [194], а также судить о нем, как о промежуточном в плане прогноза. Амплификация региона 3р, по нашим данным, имела промежуточный прогноз. Однако последующий анализ маркерных регионов соответствующего плеча хромосомы 3 позволил определить место данного нарушения.

    Маркерным регионом короткого плеча хромосомы 3, анализируемым в рамках данной работы, являлся ген ВАР1, о котором впервые в 2010 г сообщил Harbour с соавт [111]. Мутацию гена ВАР1, а именно его делецию, выявили методом MLPA в схожем с 3р количестве образцов – в 52% случаев. Еще в 16 случаев отмечена амплификация гена ВАР1, которая ранее не была описана в литературе. В процессе статистического анализа нами было показано, что амплификация может считаться вариантом нормы ввиду отсутствия разницы в выживаемости (р=0,6) и преобладанием данного нарушения в группе пациентов без МТС (р=0,002). Кроме того, было выявлено, что выживаемость пациентов при делеции гена ВАР1 уступает таковой при его нормальном статусе (3-летняя и 5-летняя выживаемость составила 63% и 58%, соответственно, для пациентов без делеции против 52% и 36 % для пациентов с делецией, р=0,012), что также было отмечено в зарубежных работах [91, 99, 111, 150]. Сопоставление полученных результатов изменений гена ВАР1 со всем коротким плечом хромосомы 3, на котором этот ген расположен, выявило совпадение в 80% случаев (kappa=0,6, 95% ДИ [0,4;0,7]). Это позволило сделать вывод о том, что использование и этого маркерного региона возможно, однако требует дальнейшего исследования.

    Молекулярно-генетическая классификация для определения 3 и 4 прогностических классов требует оценки статуса белка ВАР1 (аналог гена ВАР1) иммуногистологическим методом [134, 170, 185, 218]. Его исследование показало, что ни один из типов его экспрессии не соотносится ни с одной из групп пациентов (с МТС и без МТС), а также не имеет связи с выживаемостью (р=0,98), что полностью противоречит большинству работ, посвященных данному аспекту [89, 124, 134, 154, 185, 218]. Вопреки тому, что белок ВАР1 является суррогатным маркером для скрининга мутационного статуса гена BAP1, выявлен большой процент несовпадений результатов их исследования - 55%. Это позволяет судить о несостоятельности иммуногистохимического исследования белка ВАР1, о чем также сообщал Rodrigues M. с соавт. (2020г) [171]. Полученные данные, а также необходимость получения более объемного материала для иммуногистохимического исследования, сделали данный маркер неприменимым в рамках ТИАБ.

    Анализ длинного плеча хромосомы 3 показал, что его делеция, включая субклональную, является предиктивно неблагоприятным признаком (р=0,006): уровень 3- и 5-летней выживаемости без делеции составил 74% и 66%, соответственно, а при делеции - 52% и 38%. Учитывая тот факт, что длинное и короткое плечи хромосомы 3 являются составными частями целого, а также данные об анализе всей хромосомы 3 и ее влиянии на выживаемость пациентов с УМ, потребовалось проведение сравнительного анализа встречаемости двух нарушений в рамках одной опухоли. Совпадение результатов делеции региона 3р и 3q было отмечено в 83% случаев (kappa=0,61, 95% ДИ [0,5;0,8]). Несовпадение результатов в оставшихся 17%, а также необходимость выделения наиболее значимого маркера для последующего исследования в рамках ТИАБ потребовало проведения анализа Кокса. Впервые было проведено сравнение предиктивной «силы» двух нарушений, по результатам которого выявлена доминирующая роль региона 3р. Полученные данные являются обоснованием верного использования анализа региона 3р различными авторами в своих исследованиях.

    Изучение хромосомы 6 показало отсутствие прогностической значимости изменений короткого плеча (р=0,1). Амплификация длинного плеча хромосомы 6, по нашим данным, может иметь прогностическое значение в качестве благоприятного предиктора при относительно невысоком уровне достоверности (р=0,05). Исследования, посвященные хромосоме 6, малочисленны, однако большинство авторов придерживается мнения о положительном влиянии изменений 6q на прогноз [86, 160], что также было отмечено в нашем исследовании.

    Хромосому 8 изучали также по двум направлениям – исследовали короткое и длинное плечо. Делеция и субклональная делеция короткого плеча хромосомы 8, выявляемые в 46% случаев, достоверно чаще встречалась в группе пациентов с МТС (р=0,02). Выживаемость пациентов без делеции составила 64% и 54% на момент 3 и 5 лет, с делецией - 25% и 6%, соответственно (р<0,0001). Это полностью соотносится как с результатами самого масштабного исследования группы Shields CL с соавт. (2017г), включающего анализ 1059 образцов УМ [198], так и с результатами исследований менее малочисленных выборок [90, 157].

    Амплификация длинного плеча хромосомы 8 была выявлена в 73% случаев. Полученные результаты соответствовали имеющимся данным литературы [80, 138]. При этом выявление увеличения копийности региона 8q было ассоциировано с развитием МТС, а также с делецией двух плеч хромосомы 3 (р<0,0001). Впервые было отмечено особое место амплификации высокой степени региона 8q – выживаемость при данном нарушении с тенденцией к достоверности имела критически низкие цифры по сравнению с амплификацией (р=0,06). Так, уровень 3-х и 5-летней выживаемости при амплификации составил 49% и 32%, а при амплификации высокой степени – 26% и 16%, соответственно. Первые такие результаты требуют последующего исследования с определением необходимости выделения данного нарушения в отдельный тип. На настоящем этапе работы была предложена бинарная классификация изменения региона 8q – наличие или отсутствие амплификации, включая амплификацию высокой степени. При этом имеющиеся данные литературы о сходстве уровней выживаемости при делеции 8р и амплификации 8q не нашли подтверждения в нашей работе [55, 69, 80, 90, 127, 215]. Было отмечено, что 3- и 5-летняя выживаемость при амплификации 8q значительно превосходит такую при делеции 8р (см. выше) и составляет 42% и 26%, соответственно. Это позволило косвенно судить о различной роли двух плеч хромосомы 8 в развитии МТС УМ. При последующем проведении анализа Кокса (р<0,0001), данное суждение было подтверждено (8р: р=0,05; 8q: р=0,004). Кроме того, было отмечено, что совпадение амплификации 8q и делеции 8р встречается лишь в 57% случаев.

    Наибольшее количество несовпадений приходится на комбинацию нормального статуса 8р и амплификации 8q (43%). Проведенный методом Каплана-Майера анализ показал, что выживаемость пациентов с амплификацией региона 8q и делецией региона 8р ниже, чем без делеции, и составляет 26% и 7% против 46% и 34% для 3 и 5 лет, соответственно (р<0,0001). Это может являться основанием для пересмотра номенклатуры The Cancer Genome Atlas (TCGA) [41], не учитывающего изменения короткого плеча хромосомы 8 для определения прогностического класса и риска возникновения МТС.

    Таким образом, полученные данные впервые позволили оценивать изменения двух плеч одной хромосомы отдельно ввиду их разной предиктивной значимости: выявление амплификации региона 8q является фактором промежуточного прогноза, а комбинации делеции региона 8р с амплификацией региона 8q - фактором неблагоприятного прогноза (р<0,0001). На основании анализа молекулярных нарушений-«модификаторов» при УМ выделяют 4 прогностических класса [42, 170]. Их существование было доказано в многочисленных независимых исследованиях [55, 91, 142, 148, 156, 228], однако их сравнение, по данным литературы, не проводилось. Нами впервые на материале одной группы пациентов были проанализированы цитогенетическая и мутационная классификации.

    Показана низкая способность мутационной классификации предсказывать метастатический потенциал УМ (р=0,3), что, вероятно, обусловлено несостоятельностью иммуногистохимического исследования в определении уровня экспрессии белка ВАР1, о чем было сказано ранее. Описанные нами дополнительные прогностические классы в рамках мутационной классификации не имеют подобных описаний в литературе. По результатам анализа выживаемости, а также при проведении анализа Кокса, было показано, что единственным из мутационного профиля нарушением, имеющим предиктивную значимость, является ген EIF1AX, который является основой I и V прогностических классов. Показано, что риск возникновения МТС у пациентов с мутацией в EIF1AX в два раза ниже, чем без нее (р=0,003).

    Анализ цитогенетической классификации показал ее бОльшую предиктивную способность (р<0,0001), однако сопровождался рядом противоречий. Так, пациенты III прогностического класса, имеющие моносомию хромосомы 3, наряду с пациентами I класса, преобладали в группе пациентов без МТС, что противоречит как данным литературы, так и сути классификации. Анализ выживаемости также показал, что, вопреки ожиданиям, опухоли, по цитогенетическому тестированию относящиеся к III классу (89% и 82% для 3 и 5 лет, соответственно), связаны с более высоким уровнем выживаемости, чем относящиеся к I (76% и 70% для 3 и 5 лет, соответственно) и II (55% для 3 и 5 лет (р<0,0001). При этом достоверно низкий уровень выживаемости отмечали у пациентов IV прогностического класса, что соотносится с данными литературы, но, вероятно, связано с учетом изменений хромосомы 8 в данном прогностическом классе. Это косвенно подтверждает большую прогностическую «силу» хромосомы 8 (двух ее плеч), что также было продемонстрировано при проведении многофакторного регрессионного анализа Кокса (p<0,0001).

    Полученные данные, а также сравнение двух классификаций, выявившее совпадение прогностических классов лишь в 20% случаев (kappa = -0,007, 95% ДИ [-0,17609;0,041524]), свидетельствуют о полной разобщенности двух классификаций - мутационной и цитогенетической. Это ставит перед исследователями УМ новые задачи, заключающиеся в разработке новой прогностической классификации.

    На настоящем этапе исследования в прогностическую панель факторов, имеющих влияние на развитие МТС УМ, должны быть включены те, которые, как показано в данной работе, имеют статистически достоверную связь с МТС УМ. Среди морфологических факторов для выявления пациентов с УМ высокого риска важным маркером является наличие эпителиоидных клеток в материале ТИАБ. Среди генетических факторов изменения регионов 8р и 8q, а также мутации гена EIF1AX, необходимо расценивать как маркеры, обладающие наибольшей предиктивной силой. Изменения регионов 1р,3р, 6q, а также мутация гена GNAQ, как показало исследование, имеют связь с развитием МТС УМ, однако обладают меньшим прогностическим потенциалом.