Заключение

     В настоящий момент проблема нехватки донорской роговичной ткани в глазных банках является актуальной [69]. Недавнее глобально исследование показало, что на каждые 70 человек, нуждающихся в пересадке донорской роговицы, приходится только один роговичный трансплантат. Однако, несмотря на бессосудистую природу роговицы, отторжение роговицы является наиболее частой причиной осложнений после ее трансплантации [178, 177].

    Фемтосекундная лазерная технология СМАЙЛ (Small Incision Lenticulе Extraction – SMILE), позволяет корригировать миопию и миопический астигматизм путем формирования в строме лентикулярного материала с последующим его извлечением. В данной ситуации ЛМ является побочным продуктом технологии СМАЙЛ, что в условиях острого дефицита донорской роговичной ткани открывает широкие возможности для его использования в клинической практике, а именно для интрастромальной кератофакии [137, 37]. Известно, что еще со времен Х. Барракера предпринимались попытки использовать донорский роговичный материал после криоконсервации для интрастромальной кератофакии [44, 176, 99]. Однако для данной технологии было характерно наличие следующих осложнений: отсутствие стабильности послеоперационной рефракции, появление послеоперационного астигматизма, а также высокая частота случаев врастания эпителия и отека роговицы. Важно отметить, что технологии криосохранения роговичных тканей с тех пор постоянно развивались. Тем не менее, принципы для понимания рефракционной интрастромальной кератофакии, заложенные Х. Барракером выдержали испытание временем и до сих пор являются актуальными при лечении различных видов кератэктазий, гиперметропии, пресбиопии и миопического астигматизма [153].

    В современной литературе существуют данные о применении ЛМ, полученного по технологии СМАЙЛ в качестве истинного трансплантата для интрастромальной кератофакии при лечении различных видов кератэктазий, гиперметропии, пресбиопии, а также для иных терапевтических целей [155]. Однако в большинстве случаев использования ЛМ речь идет о его аллогенной трансплантации [165]. Данный факт означает наличие остаточных ядерных и клеточных компонентов в ткани, что обусловливает увеличение риска развития реакций иммуннологического отторжения. С целью решения данной проблемы используются методы децеллюляризации, относящиеся к технологиям тканевой инженерии и регенеративной медицины. Однако, имеющиеся на сегодняшний день данные о децеллюляризации ЛМ носят противоречивый характер и единого мнения по предпочтительному использованию конкретного протокола обработки роговичного материала на данный момент не существует.

    В зарубежной литературе также имеются данные о криоконсервации аллогенного ЛМ для решения проблем, связанных с нехваткой донорского материала в глазных банках [71, 37, 155, 125]. В 2019 году сингапурские исследователи высказали идею о создании банка хранилищ для криосохраненных децеллюляризированных ЛМ [155]. Данная идея так и не нашла своей практической реализации в связи с наличием ограничивающих факторов, включающих следующие проблемы: отсутствие оптимального протокола децеллюляризации ЛМ, отсутствие протокола криоконсервации ДЛМ и потенциальной токсичности ДЛМ после криоконсервации. Кроме того, также существуют проблемы отсутствия точных математических формул и диаграмм, учитывающих параметры лентикулярного материала с целью усиления рефракции глаза при интрастромальной кератофакии. Поэтому на данный момент особенно перспективным является создание банка криосохраненных децеллюляризированных ЛМ, позволяющем создать большой пул роговичной ткани в короткие сроки с потенциально неограниченным сроком хранения. В связи с необходимостью разработки оптимальных условий для децеллюляризации ЛМ с последующей его криоконсервацией для использования в рефракционной хирургии роговицы были сформулированы цели и задачи настоящего исследования.

    Цель исследования: Разработать технологию криоконсервации децеллюляризированного лентикулярного материала, полученного в процессе фемтосекундных лазерных рефракционных операций, для коррекции гиперметропии в эксперименте.

    Задачи

    1. Провести сравнительный анализ известных способов децеллюляризации роговичной ткани и выявить из них наиболее оптимальный для лентикулярного материала методами физического, генетического и иммуногистохимического анализов.

    2. Разработать протокол криоконсервации децеллюляризированного лентикулярного материала на основании физических и ультраструктурных характеристик методами спектрофотометрии и сканирующей электронной микроскопии.

    3. Изучить цитотоксические свойства криоконсервированного лентикулярного материала в присутствии кератоцитов с помощью культуральных и иммунногистохимических методов исследований.

    4. На основании математического моделирования произвести расчет параметров лентикулярного материала необходимого для его имплантации в строму роговицы с целью коррекции гиперметропии.

    5. Произвести морфометрическую оценку роговиц кадаверных глаз человека после имплантации криоконсервированного лентикулярного материала с учетом результатов математического моделирования методами оптической когерентной томографии и сканирующей кератотопографии.

    Исследование было проведено в 2 этапа, соответственно поставленным задачам.

    На первом этапе для разработки протокола криоконсервации ДЛМ сначала требовалось выбрать наиболее оптимальный протокол децеллюляризации ЛМ из известных в литературе. Дополнительно в рамках первого этапа проводили сравнение прозрачности нативных образцов в разных транспортировочных средах. Для этого ЛМ переносили в транспортировочных средах из операционной до лаборатории ГТБ, где проводили спектрофотометрический анализ образцов с целью выбора среды, обеспечивающей большую прозрачность. В зарубежной практике, как правило, транспортировка ЛМ из операционной до лаборатории проводится в два этапа: на первом этапе образцы помещаются во флаконы с раствором PBS или со средой для хранения роговицы, на втором этапе после доставки материала в лабораторию ГБ перед спектрофотометрическим исследованием ЛМ дегидратируют в глицерине, с целью устранения неспецифического отека тканей [89, 196, 195]. Предполагается, что при спектрофотометрическом анализе данный отек может повлиять на точность измерения прозрачности роговичной ткани. В зависимости от используемой среды для транспортировки ЛМ было сформировано 4 группы: группа 1 – «Раствор для хранения роговицы» (среда Борзенка-Мороз) (n=15), группа 2 – «Средство для консервации заднего послойного трансплантата донорской роговицы» (n=12), группа 3 – КВ (n=12), группа 4 – ДВ (n=14). В исследовании в качестве альтернативы глицерину использовались КВ и ДВ.

    По результатам исследования прозрачности образцов, исследуемые группы располагались в порядке снижения признака следующим образом: группа 4 - 89,35±2,38% (89,6 (88,22-90,5)), группа 3 - 87,64±2,28% (87,89 (86,65-88,9)), группа 2 - 84,85±2,47% (85,43 (83,65-86,21)); группа 1 - 82,54±2,57% (82,56 (80,84-84,1)). Было доказано, что использование ДВ в качестве среды для транспортировки образцов дает наилучшие результаты прозрачности 89,35±2,38% (89,6 (88,22-90,5)). В доступной литературе отсутствуют данные, где проводились исследования в области изучения прозрачности нативного ЛМ в различных транспортировочных средах для спектрофотометрического анализа. Возможно, данное обстоятельство связано с тем, что двухэтапность использования разных сред (PBS, либо среда для хранения роговицы и глицерин) для спектрофотометрического анализа ЛМ не вызывает значимых затруднений для исследования прозрачности роговичной ткани. Однако, в данном исследовании впервые показано, что применение одного ДВ в качестве транспортировочной среды для спектрофотометрии, позволяет проводить измерение прозрачности ЛМ в один этап, тем самым упрощая данную процедуру. Кроме того, использование ДВ является оправданным, поскольку данная среда нетоксична, обладает по аналогии с глицерином дегидратирующими свойствами и часто используется в офтальмохирургии, что означает ее высокую доступность в операционном блоке. Тем не менее, выбор транспортировочной среды и этапность для спектрофотометрического анализа прозрачности нативных ЛМ остается на усмотрение исследователя.

    С целью выбора оптимального протокола децеллюляризации были использованы разные протоколы, и в соответствии с этим были сформированы 4 группы: 1) контроль (нативные образцы); 2) 1,5M раствор NaCl с нуклеазами (NaCl); 3) 0,1% раствор SDS (SDS); 4) 0,25% раствор Трипсин-ЭДТА с нуклеазами и двойным отмыванием в гипотоническом трисбуфере (Трипсин-ЭДТА). Оценку результатов эффективности децеллюляризации проводили с помощью спектрофотометрии, гистологического и иммунногистохимического анализов, СЭМ, а также ДНК-анализа.

    При спектрофотометрическом анализе данных было выявлено, что наиболее приближенными к контрольной группе были группы 2 и 3 (р≥0,05), а в группе 4 наблюдалось значимое снижение прозрачности при сравнении с контролем (р≤0,05). При проведении гистологического и иммунногистохимического анализов все протоколы децеллюляризации эффективно удаляли клеточный и ядерный материалы. Тем не менее, при сохранности основных компонентов ВКМ в группах 2 и 3, в группе 4 отмечалось значимое повреждение ВКМ.

    При анализе СЭМ было показано, что наиболее близкий к контролю являлся результат группы 2, а наибольшая толщина фибрилл коллагеновых волокон наблюдалась в группе 4. Анализ содержания остаточной ДНК, продемонстрировал эффективность всех протоколов децеллюляризации (меньше 50 нг/мг), что соответствовало предложенным Crapo с соавт. (2011) требованиям [54]. В группе 4 отмечалось самое низкое содержание остаточного ДНК 13,42±7,4 нг/мг (11,45 (8,47-16,86)). В доступной литературе встречаются противоречивые данные при сравнении одних и тех же протоколов децеллюляризации [195, 163]. В настоящем исследовании показано, что протоколы децеллюляризации (NaCl и SDS) обеспечивают удаление клеточных компонентов из роговичной ткани, ее высокую прозрачность при сохранности ультраструктуры ВКМ, что соответствовало данным литературы [195, 196, 163]. Протокол децеллюляризации – Трипсин-ЭДТА не подтвердил результаты исследователей Huh M. I. с соавт. (2018), где используемые растворы 0,25% и 0,5% Трипсин-ЭДТА с нуклеазами и двойным отмыванием в гипотрис-буфере показали свою эффективность в сохранении прозрачности ЛМ, удалении ядер и ДНК из ткани [89]. В настоящей работе было показано, что протокол 0,25% Трипсин-ЭДТА с нуклеазами в гипотрис буфере приводит к эффективному удалению клеточных элементов из ЛМ и значимому снижению уровня ДНК- фрагментов в ДЛМ. Однако, вместе с тем, данный протокол оказывал разрушительное воздействие на ультраструктуру ВКМ, что приводило к снижению прозрачности лентикулярного материала. Кроме того, мы считаем, что любое дополнительное введение детергентного вещества к исходному раствору для децеллюляризации вызывало увеличение суммарного агрессивного воздействия на структуру ВКМ роговичной ткани, и как следствие приводило к снижению ее прозрачности [47]. Так, в протоколе с Трипсином-ЭДТА использовались 4 детергентных компонента: 1)Трипсин – фермент; 2) ЭДТА – хелатирующий агент; 3) нуклеазы – ферменты, фрагментирующие ДНК; 4) гипотонический трисбуфер – раствор способный лизировать клетки через осмотический шок, увеличивая при этом проникновение реагентов внутрь ткани [142].

    Таким образом, в соответствии с поставленной 1-ой задачей с помощью физического, генетического и иммуногистохимического анализов при проведенном сравнительном анализе известных способов децеллюляризации ЛМ были выявлены 2 наиболее оптимальных протокола – 1) 1,5М NaCl с нуклеазами, 2) 0,1% раствор SDS.

    Для решения 2-ой задачи в рамках 1-ого этапа исследования для разработки протокола криоконсервации ДЛМ сначала изучали влияние дегидратации ДЛМ перед его хранением в ДМСО на его прозрачность с помощью спектрофотометрии.

    Для этого проводили сравнение прозрачности ДЛМ перед хранением в DMSO без добавления ДВ (NaCl-ДМСО без ДВ) и с добавлением ДВ к образцам (NaCl-ДМСО с ДВ). В соответствии с этим были сформированы три группы: группа 1 – нативные образцы (n=25); группа 2 – NaCl-ДМСО без ДВ (n=19); группа 3 – NaCl-ДМСО с ДВ (n=19). Результаты сравнения групп между собой и контрольной группой не выявили статистически значимой разницы (р≥0,05). По-видимому, ДВ, обволакивая ткань создает дополнительные ограничивающие условия для проникновения криопротектора в коллагеновые волокна. Хотя, группа 2 является отечной, криопротектор ДМСО лучше проникает в ткань из-за отсутствия барьера в виде ДВ. Известно, что ДМСО является мембранопроникающим криопротектором, способным образовывать прочные водородные связи с молекулами воды, тем самым препятствуя избыточной кристаллизации ткани [13].

    Таким образом, дегидратация ДЛМ в ДВ перед его хранением в ДМСО не является обязательным условием для получения образцов с высокими показателями прозрачности.

    Далее в исследовании при разработке протокола криоконсервации ДЛМ (NaCl и SDS) использовали три среды (криопротекторы): ДМСО, Криодерм и глицерин. Оценивали результаты прозрачности и ультраструктуры матрикса образцов с помощью методов спектрофотометрии и СЭМ. В соответствии с этим было сформировано 7 групп: 1) Контроль (n=25); 2) NaCl–ДМСО (n=18); 3) SDS–ДМСО (n=16); 4) NaCl–Криодерм (n=17); 5) SDS–Криодерм (n=18); 6) NaCl–глицерин (n=19); 7) SDS–глицерин (n=21). Для метода СЭМ использовалось по 3 образца каждой группы.

    Суммируя данные спектрофотометрического исследования, было установлено, что группа 2 (NaCl–ДМСО) является наиболее оптимальной в рамках прозрачности 89,44±2,68% (89,52 (87,99–91,18)). По результатам оценки СЭМ анализ данных не выявил достоверной статистической разницы при сравнении следующих групп: 1–2; 1–4; 2–3; 2–4; 3–5; 6–7 (р≥0,05). Проведенный анализ также показал, что использование криопротектора глицерина является непригодным для хранения образцов, прошедших процедуру децеллюляризации в NaCl и SDS.

    Wilson c соавт. (2016) сообщали, что глицерин вызывает дополнительную дезорганизацию коллагена и может маскировать структурные повреждения, вызванные процедурой децеллюляризации [189]. Для группы 2 (NaCl–ДМСО) было характерно схожее состояние фибрилл коллагеновых волокон с группой нативных образцов.

     Для подтверждения стерильности было проведено Санитарно-бактериологическое исследование образцов NaCl-ДМСО (n=5). Контроль результатов исследования показал, что в течение 14 суток наблюдения во всех случаях не было выявлено роста патогенных колоний микроорганизмов.

    Таким образом, в соответствии с поставленной 2-ой задачей на основании результатов данных спектрофотометрии и СЭМ был разработан протокол криоконсервации децеллюляризированного ЛМ (NaCl–ДМСО), позволяющий получить высокие показатели прозрачности образцов при минимальном нарушении ультраструктуры коллагеннового матрикса:

    1. Протокол децеллюляризации с использованием 1,5М раствора NaCl с ДНКазой 5 Ед/мл и РНКазой 5 Ед/мл (см. глава 2.2., Таблица 3)

    2. Отмывание от детергентов в 1 мл раствора PBS (трехкратно) по 5 минут

    3. Перенос образца в криопробирку, содержащую 1 мл 90% «Раствора для хранения роговицы» (ООО НЭП «Микрохирургия глаза», Москва) и 10% ДМСО (PanReac AppliChem, Германия).

    4. Помещение криопробирки в контейнер для криоконсервации Cool Cell LX (Biocision, США) с последующим его переносом в низкотемпературный морозильник (-80 °С) на ночь.

    5. На следующий день изъятие криопробирки из контейнера и перенос ее в сосуд Дьюара (Cryo Diffusion, Франция) с жидким азотом с температурой –196°С. Хранение до начала эксперимента.

    6. В день эксперимента изъятие криопробирки из Сосуда Дьюара и размораживание на водяной бане при +37 °С в течение 5 минут.

    7. Проведение трехкратного цикла отмывания образца от криопротектора: 1) отмывание (трижды) в 1 мл раствора PBS по 5 минут; 2) помещение образца в термошейкер с последующим отмыванием в 1 мл раствора PBS при комнатной температуре в течение ночи; 3) на следующий день трехкратное отмывание в 1 мл PBS по 5 минут.

    В литературе существуют данные о криоконсервации нативного лентикуляного материала, где в качестве криопротекторов использовались ДМСО и глицерин [137, 71, 125]. Важно отметить, что во всех вышеприведенных исследованиях речь шла об аллогенной трансплантации нативного ЛМ. Данный факт увеличивает риск отторжения ткани при имплантации нативного ЛМ в строму роговицы из-за наличия в нем клеток [54]. Liu с соавторами (2017) показали хорошую прозрачность нативных ЛМ в глицерине, сохраненных в течение 4 недель при комнатной температуре [125]. В нашей работе для долгосрочного хранения децеллюляризированного ЛМ (NaCl и SDS) использовали глицерин при -80 °С. Данные протоколы криоконсервации (NaCl-глицерин и SDS-глицерин) приводили к разрушению ультратруктуры матрикса и снижению прозрачности образцов. Кроме того, все протоколы криоконсервации на основе децеллюляризированного ЛМ с помощью SDS показали низкую прозрачность образцов и нарушение структуры коллагеннового матрикса, что было подтверждено данными спектрофотометрии и СЭМ. Так как известно, что структура SDS аналогична структуре фосфолипидной мембраны (имеет гидрофильную головную группу и гидрофобный хвост) [95]. Вероятнее всего, после отмывания ткани от детергентов, в ткани присутствует небольшая концентрация SDS. С помощью гидрофильной группы SDS происходит процесс дополнительного связывания молекул SDS с молекулами воды, что является критичным моментом при замораживании ткани. По-видимому, избыточное связывание молекул SDS с водой и их взаимодействие с криопротектором приводит к повышенному образованию кристаллов льда в роговичной ткани, и как следствие вызывает снижение ее прозрачности при размораживании.

    В описанной литературе отсутствуют данные о разработке протокола криоконсервации для децеллюляризированного лентикулярного материала. Это может быть связано с тем, что для разработки данного протокола требуется создать определенные условия: логистическая проблема доставки ЛМ из операционной медицинского учреждения до лаборатории ГТБ, доступность к специализированному и дорогостоящему лабораторному оборудованию, наличие специальных расходных материалов, подготовленные специалисты. В действительности соблюдение всех условий для успешной реализации данного проекта является труднодостижимой целью. Реализация разработки протокола криоконсервации ДЛМ в головной организации ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. С.Н. Федорова» Минздрава России стала возможной благодаря одновременному наличию в структуре учреждения операционного блока и лаборатории ГТБ, учитывающих все вышеприведенные условия.

    В связи с необходимостью изучения потенциальной токсичности полученного ДЛМ после криоконсервации (NaCl-ДМСО) для его предполагаемого клинического использования, в данной работе в соответствии с поставленной 3-ей задачей исследования была изучена жизнеспособность и выживаемость кератоцитов в присутствии криоконсервированного ДЛМ (NaCl-ДМСО) с помощью теста «Live and Dead», метода «ДНК-комет» и МТТ-теста. Так, на основании вышеприведенных методов исследования цитотоксичности было выявлено сохранение жизнеспособности клеточной культуры кератоцитов на всем сроке наблюдения (9 суток) по результатам МТТ-теста; и до 3-х суток по результатам теста «Live and Dead» и метода «ДНК-комет». Таким образом, использование криоконсервированного ДЛМ (NaCl-ДМСО) в присутствии кератоцитов не вызывает выраженного цитотоксического эффекта.

    Второй этап включал в себя разработку математической формулы и диаграммы, на основе параметров лентикулярного материала, необходимых для достижения гиперметропической коррекции при интрастромальной кератофакии, которые были показаны в эксперименте ex vivo.

    В соответствии с поставленной 4-ой задачей исследования была выведена математическая формула для проведения практических расчетов: где 337,5 – коэффициент перевода оптической силы роговицы (дптр) в радиус кривизны (мм); 0,8 – значение средней конической константы роговицы до операции; 1,2 – значение средней конической константы роговицы после операции; 1000 – переводной коэффициент (мкм); Нл– толщина лентикулярного материала (мкм); К – среднее значение кератометрии в центре роговицы (дптр); S – диаметр лентикулярного материала (мм); Ef– заданный рефракционный эффект, приведенный к поверхности роговицы (дптр).

    На основании данной формулы была разработана диаграмма для выбора образца из банка ЛМ необходимого для коррекции гиперметропии при интрастромальной кератофакии.

    Таким образом, разработанные математическая формула и диаграмма, учитывающие параметры ЛМ для его имплантации в строму роговицы с целью коррекции гиперметропии позволили перейти к 5-ой задаче исследования.

    Так как вышеприведенные формула и диаграмма, учитывали толщину ЛМ схожую с толщиной образцов, полученной при проведении кераторефракционной операции СМАЙЛ. В связи с этим, перед началом эксперимента ex vivo необходимо было возвратить увеличенную толщину ЛМ после криоконсервации к исходным его параметрам для успешной имплантации образцов в строму роговицы. Для решения данной проблемы изучали влияние разных вискоэластиков на криоконсервированный ДЛМ (NaCl-ДМСО). В соответствии с этим, для устранения неспецифического отека криоконсервированного ДЛМ были использованы ДВ (n=22) и КВ (n=23). Измерение толщины образцов проводили с помощью метода ОКТ.

    Результаты данного исследования показали, что после добавления ДВ к образцам, их толщина постепенно уменьшается, и в интервале от 30 минут до 60 минут выходит на плато, возвращаясь при этом к исходной толщине (р≥0,05). Использование КВ не приводит к достаточному дегидратирующему эффекту.

    Феномен дегидратирующего свойства ДВ можно обьяснить составом данного вискоэластика: 3,0% гиалурoнат натрия и 4,0% хондроитин сульфат. Хондроитин сульфат успешно используется как агент, стабилизирующий отек роговичного трансплантата и входит в состав «Раствора для хранения роговицы» (среда Борзенка-Мороз) [5]. В существующей литературе данные о применении ДВ в качестве дегидратирующей среды для криоконсервированного ДЛМ (NaCl-ДМСО) отсутствуют.

    В эксперименте ex vivo морфометрические изменения роговиц (n=10) определялись до- и после имплантации образца NaCl-ДМСО в ДВ (n=10) в строму роговицы, которые исследовали с помощью методов кератотопографии Pentacam в пределах 7-миллиметровой зоны (Km, дптр) и ОКТ (центр образца, мкм) при постоянной клинической нормотензии глаза (тонометрия по Маклакову, около 15 мм.рт.ст.)

    Так, в соответствии с разработанной формулой и диаграммой для коррекции гиперметропии в + 6 дптр в банке образцов имеется ЛМ с параметрами: Нл 94 мкм, S 6,5 мм, полученный после операции СМАЙЛ при коррекции миопии 4,5 дптр.

    Результаты кератотопографии показали, изменение среднего значения передней кривизны роговицы кадаверного глаза (Km) до- и после имплантации образца с 44,8 дптр до 51,2 дптр, что соответствовало усилению рефракции роговицы около 6 дптр. Исследование ОКТ также выявило изменение толщины роговицы до- и после имплантации с 702 мкм до 796 мкм, с учетом толщины фемто-клапана (130 мкм). В существующей литературе. Результаты настоящего исследования соответствуют данным литературы в отношении теории, в соответствии с которой, сила имплантированного ЛМ (дптр), полученной при коррекции миопии после операции СМАЙЛ, должна быть меньше, чем предполагаемый рефракционный результат [112]. Рядом исследователей также было изучено влияние глубины трансплантации ЛМ в строму роговицы (100 мкм, 110 мкм, 120 мкм, 160 мкм), необходимой для коррекции гиперметропии [122, 187, 126, 203, 148, 173, 112, 56, 138]. Было установлено, что трансплантация ЛМ на глубину 160 мкм приводит к снижению рефракционного эффекта, и наоборот, поверхностная имплантация ЛМ в строму роговицы приводила к усилению рефракции глаза [187, 56]. В настоящей работе поверхностная имплантация образца в строму роговицы – на глубину 130 мкм, учитывающая его параметры согласно разработанным формуле и диаграмме, позволила достичь целевой рефракции глаза. Таким образом, разработанные формула и диаграмма для расчета ЛМ с целью коррекции гиперметропии при интрастромальной кератофакии могут быть востребованы на начальном этапе клинических исследований.

    Таким образом, можно сделать заключение: оптимальные протоколы децеллюляризации, полученные при сравнительном анализе известных методов позволяют создавать бесклеточные каркасы с высокими прозрачностными свойствами, что подтверждается данными спектрофотометрии, гистологического анализа, иммунногистохимического анализа, сканирующей электронной микроскопии и ДНК-анализа. Разработанный протокол криоконсервации децеллюляризированного лентикулярного материала является безопасным, характеризуется высокими показателями прозрачности без грубого нарушения ультраструктуры коллагенового каркаса, что подтверждается данными спектрофотометрии и сканирующей-электронной микроскопии. Кроме того, данный протокол не оказывает выраженного цитотоксического воздействия на кератоциты.

    Разработанные математическая формула и диаграмма позволяют достигать целевого рефракционного эффекта на роговице кадаверных глаз при интрастромальной кератофакии, что подтверждается данными ОКТ и Pentacam.

    Проведенное доклиническое исследование децеллюляризированного лентикулярного материала, прошедшего криоконсервацию, подтверждает высокую эффективность и безопасность данных образцов в рефракционной хирургии роговицы и является перспективным для дальнейших экспериментальных исследований с целью внедрения в клиническую практику для лечения различных патологических состояний роговицы.