Рис. 1. Панорама глазного дна кролика после моделирования фотоиндуцированного тромбоза ЦВС: а) 1 сутки; б) 3 сутки; в) 7 сутки. Макромикроскопическое препарирование заднего отдела энуклеированных глаз, ув. х10
Рис. 2. Модель фотоиндуцированного тромбоза ЦВС у кролика (1 сутки). Отек зрительного нерва (а) и сетчатки (б), начало формирование тромба в ЦВС с явлениями эктазии и сладж-синдрома в венулах, диапедезные кровоизлияния с пропитыванием сетчатки. Окраска гематоксилин-эозин, ув. а) х50; б) х200
В настоящее время ни один из имеющихся методов лечения тромбозов ретинальных вен (консервативный, лазерный, хирургический) не гарантирует пациенту благоприятный исход процесса [7, 9].
Разработка новых методов лечения, а также оценка их эффективности возможны только в условиях эксперимента, поэтому актуальным является создание адекватных моделей тромбозов ветвей ЦВС.
Существующие на сегодняшний день экспериментальные модели, получаемые лазерными и хирургическими способами, сопровождаются высокой травматичностью, высоким риском осложнений, отличаются низкой воспроизводимостью и преходящим характером тромбоза [8, 11, 13-17, 19].
Цель
Разработать и экспериментально обосновать фотоиндуцированную модель тромбоза ветви центральной вены сетчатки.
Материал и методы
Экспериментальное моделирование тромбоза ветви ЦВС выполнено на 10 кроликах (10 глаз) породы шиншилла весом 1,5-2 кг.
Рис. 3. Модель фотоиндуцированного тромбоза ЦВС у кролика (3 сутки). В ЦВС на фоне отека зрительного нерва (а) формирование пристеночного «красного» (эритроцитарного) тромба (б). Неравномерное тромбирование в венулах сетчатки, появление в стенках «сосудистых почек» (в, г) — начало неоваскуляризации. Окраска гематоксилин-эозин, ув. а) х50; б, в, г) х200
Рис. 4. Модель фотоиндуцированного тромбоза ЦВС у кролика (7 сутки). Частичная облитерация сосудов на внутренней поверхности сетчатки, сохранение неоваскуляризации в отечной части слоя нервных волокон оптикоганглионаров «зрительной лучистости» вблизи диска зрительного нерва. Окраска гематоксилин-эозин, ув. а) х50; б) х350
Животным внутривенно вводили ФС в дозе 2,5 мг/кг веса. Через 15 мин (время, достаточное для максимального накопления ФС в сосудах сетчатки по данным флуоресцентной диагностики [1]) транспупиллярно проводили лазерное облучение ретинальных сосудов на выходе из диска зрительного нерва с плотностью энергии 200 Дж/см2.
Диаметр пятна лазерного излучения составлял 3,0 мм, что соответствует двум диаметрам диска зрительного нерва (ДЗН) кролика.
Методы обследования включали офтальмоскопию с фоторегистрацией, флуоресцентную ангиографию, оптическую когерентную томографию (ОКТ) («Stratus OCT3000», «Carl Zeiss», Германия). Срок наблюдения с последующим выведением из эксперимента — через 30 мин после фотодинамического воздействия, на 1, 3, 7 и 14 сутки.
Для проведения морфологических исследований энуклеированные глазные яблоки фиксировали в растворе нейтрального формалина, подвергали макромикроскопическому препарированию, затем промывали проточной водой, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин, выполняли серии меридиональных гистологических срезов с применением окраски гематоксилин-эозином.
Препараты изучали под микроскопом фирмы Leica DM LB2 при x50, х200, х400-кратном увеличении с последующим фотографированием.
Результаты
Через 30 мин после фотодинамического воздействия офтальмоскопически отмечали сужение артерии, расширение, извитость и напряжение пораженной вены; вдоль сосудистой аркады — множественные интраретинальные штрихообразные кровоизлияния; отек перипапиллярно по ходу сосудистой аркады и в центральной зоне сетчатки; границы диска зрительного нерва слегка смазаны за счет отека.
К первым суткам количество геморрагий увеличилось, отмечалось большое число экстравазатов вокруг пораженного сосуда, отек тканей усиливался. На 3-и сутки число геморрагий и экстравазатов уменьшалось, отек тканей нарастал и достигал пика. Тромбированная ветвь была полнокровной, имела патологическую извитость, четкообразность, темную окраску, отмечалось появление микроаневризм, расширение капиллярной сети.
К 7-м суткам наблюдали дальнейшее уменьшение геморрагий и экстравазатов, вена сохраняла патологическую извитость, неравномерный калибр и темную окраску, соответствующая артерия имела прямолинейный ход, была сужена, отмечался симптом «серебряной проволоки», отек тканей уменьшился.
К 14-му дню кровоизлияния частично рассасывались, однако отек сетчатки над пораженной аркадой и центральной зоной сохранялся, что подтверждалось данными ОКТ.
После энуклеации результаты были подтверждены при макромикроскопическом препарировании глаз животных (рис. 1).
По данным флуоресцентной ангиографии на 1 сутки после моделирования выявлялось отсроченное заполнение контрастом окклюдированного венозного сосуда по сравнению с другими ветвями ЦВС, кровоток в поврежденном сосуде был резко затруднен, в области формирования тромба сосудистая стенка прокрашивалась контрастным веществом, отмечалось удлинение венозной перфузии, неравномерное контрастирование вен.
К 3-м суткам окклюдированный сосуд не заполнялся контрастом и выглядел темным, тогда как остальные ветви ЦВС были заполнены флюоресцеином, отмечалось сужение артерий, отсутствие нормального ветвления. В бассейне пораженного сосуда отмечалось отсутствие перфузии в капиллярах сетчатки, на границах зон ишемии капилляры были резко расширены и имели вид «обрубков», что особенно хорошо проявлялось на 7-е сутки наблюдения. В этих же зонах выявлялись капиллярные аневризмы, отмечался выход флюоресцина за пределы сосуда. В поздних фазах наблюдался гиперфлюоресценция ДЗН и в зонах отека сетчатки, перфузия в перифовеолярных капиллярах была нарушена.
По данным ОКТ в 1-е сутки отмечалось увеличение толщины сетчатки на 60-70 мкм — в среднем до 199 мкм (толщина интактной сетчатки — до 132 мкм), определялись участки серозной отслойки нейроэпителия парапалиллярно (высотой до 357 мкм), а также множественные преретинальные и интраретинальные кровоизлияния. При исследовании на 3-и сутки зон экссудативной отслойки нейроэпителия выявлено не было, однако сохранялся диффузный отек сетчатки (высотой до 190 мкм). На 7-е сутки после эксперимента происходила полная резорбция отека. Через 2 недели начинал формироваться неравномерно пигментированный хориоретинальный атрофический очаг.
Результаты морфологических исследований. На первые сутки в гистологических препаратах отмечали выраженный отек ДЗН и перипапиллярных участков сетчатки, полнокровие всех сосудов этой зоны, способствующее агрегации форменных элементов крови с явлениями сладж-синдрома. В поверхностных венулах наблюдали значительное повышение проницаемости сосудистой стенки, что привело к диапедезным кровоизлияниям без нарушения целостности сосудов. Свободные эритроциты оседали с формированием мелких кровоизлияний в кортикальных слоях стекловидного тела глаза, но основная масса их пропитывала сетчатку, усугубляя ее структурные нарушения (рис. 2).
К 3 суткам явления отека нарастали, особенно он был выражен в начальном отрезке зрительного нерва, но кровоизлияния носили очаговый поверхностный характер, в основном в слое нервных волокон перипапиллярной сетчатки. Сладж-синдром перешел в тромбоз крупных сосудов, в ЦВС на месте разрушенного эндотелия отмечали отложение фибрина, скопление лейкоцитов с формированием пристеночного «красного» тромба из-за обильного пропитывания эритроцитами.
В венулах тромбирование было неравномерным, было выявлено чередование с сохранением просвета сосуда и появлением в стенках «сосудистых почек» — развитие неоваскуляризации (рис. 3).
К 7 суткам количество новообразованных сосудов увеличивалось.
На фоне неравномерного тромбирования и частичной облитерации мелких сосудов на внутренней поверхности сетчатки они сохранялись в ее толще, особенно в отечной части слоя нервных волокон оптикоганглионаров «зрительной лучистости» вблизи ДЗН. Недосформированность стенки новообразованных сосудов приводила к появлению мелких диапедезных экстравазатов (рис. 4).
По истечении двух недель пролиферативные процессы сменялись инволютивными. Отмечено сохранение неравномерной отечности, очаговый глиоз сетчатки, замещение фиброзной тканью участков деструкции оболочек и зрительного нерва с тенденцией к формированию хориоретинального рубца.
Обсуждение
Модели тромбозов ветвей ЦВС обычно создавали при помощи высокоинтенсивной лазеркоагуляции и изучали на них вопросы патогенеза и ангиогенеза, а также разрабатывали некоторые методы лечения этой патологии [13-16]. Однако процесс создания этих моделей сопровождался высоким риском интравитреальных кровоизлияний, получить тромбоз ветви вены удавалось лишь в 50% случаев, кроме того, он носил преходящий характер. Создание моделей с использованием хирургических методов также сопровождалось осложнениями (выраженная экссудация, отслойка сетчатки, интравитреальные геморрагии) и требовало высокой квалификации хирурга [17, 19].
На наш взгляд, для создания модели тромбоза ветви ЦВС целесообразно использовать фотодинамический эффект, основой которого выступает индуцированное фотохимическое повреждение клеток эндотелия сосудов, приводящее к стазу и агрегации клеток с последующей окклюзией [10, 18]. Исходя из этого, получение тромбоза с использованием фотодинамического воздействия является патогенетически обоснованным в сравнении с ранее существующими методиками, так как механизм формирования тромба в естественных условиях связан именно с повреждением эндотелиальных клеток без нарушения целостности сосудистой стенки.
При проведении фотодинамического воздействия ключевым моментом является выбор ФС [5, 6, 12].
Наиболее перспективными являются отечественные препараты хлоринового ряда. Данные ФС отличаются высокой фотодинамической активностью в малых дозах, высоким контрастом накопления в тканях, низкой фототоксичностью, быстрой элиминацией из организма.
В наших исследованиях мы получили фотоиндуцированную модель, что офтальмоскопически проявлялось картиной тромбоза ветви ЦВС уже в первые сутки после воздействия. В течение следующих дней картина нарастала и достигала пику к третьему дню. Затем наблюдалось частичное рассасывание кровоизлияний с формированием микроаневризм. На всех сроках наблюдения отмечался отек сетчатки различной степени выраженности.
Наличие отека сетчатки вокруг ДЗН и в зоне проекции макулы подтверждалось методом ОКТ. Следовательно, клиническая картина полученной модели полностью соответствует клиническим проявлениям тромбоза ветви ЦВС, что указывает на адекватность и легковоспроизводимость полученной модели.
Ангиографически показано нарушение кровотока в поврежденных сосудах, а к 3-м суткам — полное отсутствие их контрастирования. Отмечается прокрашивание окружающих тканей, что указывает на отек сетчатки, а в последующем — наличие темных зон ишемии сетчатки и формирование микроаневризм. Таким образом, ангиографическая картина полученной модели подтверждает формирование тромба в зоне фотодинамического воздействия, что также свидетельствует об адекватности полученной модели.
Гистологически также подтверждено тромбообразование в ЦВС с динамическими особенностями этого процесса. Уже на первые сутки были отмечены предрасполагающие факторы (повреждение эндотелия, сладж-синдром, повышенная проницаемость сосудистой стенки, отек), способствующие агглютинации тромбоцитов и коагуляции фибриногена. Далее усиливалось пристеночное внутрисосудистое прикрепление тромба, отмечено появление дополнительных фиброзных структур, оседание на них форменных элементов крови, все больше перекрывающих просвет сосуда. Эти процессы сопровождались отеком и ишемическими изменениями в близлежащих оболочках с компенсаторным развитием неоваскуляризации. Данная морфологическая картина полностью подтверждала наличие тромба, формирование и строение которого соответствует патогенезу образования тромба в естественных условиях.
Заключение
Посредством офтальмоскопии, оптической когерентной томографии, флуоресцентной ангиографии и гистологических исследований доказано, что полученная нами модель является моделью тромбоза ветви ЦВС. Достоинствами этой модели выступают дозируемость, адекватность, легковоспроизводимость, малотравматичность и патогенетическая обоснованность. Кроме того, методика отличается своей относительной неинвазивностью, что также является ее достоинством.
Метод дозированного и избирательного фотодинамического воздействия позволит моделировать исходы структурных изменений в глазном яблоке при тромбозе ЦВС: компенсировать это состояние, вызвав реканализацию тромба, или необратимостью процессов привести к субатрофии глаза, что требует расширения задач эксперимента.
Мы полагаем, что использование данной модели является перспективным и целесообразным при создании и изучении новых методик лечения тромбоза ветвей ретинальных вен, а также для изучения различных вопросов патогенеза данного заболевания.
